ラットDNAポリメラ-ゼβとDNA複合体の結晶化

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ラットDNAポリメラ-ゼβとDNAとの相互作用、即ちポリメラ-ゼ活性の機能構造相関をX線結晶解析を用いて明らかにすることを目指し、DNAポリメラ-ゼβとオリゴヌクレオチドとの複合体の結晶化実験を行った。この実験の背景は以下の様である.DNAポリメラ-ゼβはDNAポリメラ-ゼ活性のX線結晶解析を用いた機能構造相関を探るのに良い系と私係は考えている。理由の一つは、この酵素は分子量4万の単一のポリペプチド鎖で、数あるDNAポリメラ-ゼの中で最小のものだからである。次には私達の研究で、この高純度の標品を使うことにより、酵素だけの小さい結晶、基質dATPとの複合体の薄い板状結晶が得られているからである。基質dATPとの複合体は、ポリエチレングリコ-ル(PEG)と各種の塩(ポリメラ-ゼ反応は少量の塩を必要とする)の共存下でできたので、先ずこのような条件下で結晶化条件を捜した。この時、以下のようなDNAオラゴマ-を用いた時に小さい針状の結晶が得られた.(1)テンプレ-トープライマ複合体モデルとして12merテンプレ-トAGACCGGCCCGGと9merプライマCCGGGCCGGを用いた場合。MgdATP存在下で小さい(0.1x0.01x0.01mm)針状の結晶が得られた。(2)10mer(dT10)を用いた場合。(1)と同様な条件下で同じような結晶が得られた。しかしMgdATPを加えない場合、また加えても短いDNAオリゴマ(dT4)を用いた場合結晶は得られなかった。従ってこれらの結果から、ポリメラ-ゼβーDNA複合体結晶を得るには、(1)10mer程度の長さを持つDNAフラグメントを用いる、(2)MgdATPを共存させる、の二つの必要な点が明らかになった。このようにポリメラ-ゼβーDNA複合体結晶を得ることができたが、結晶の大きさが十分ではなく更にこれから結晶化条件を検討していく必要がある。