Optical analysis of the oxygen-regulated assembly of hypoxia inducible factor-1 (HIF-1) by means of 2 photon laser FRET and FRAP

Ziel des Projektes is es，das Verständnis der hypoxieinduzierten Genexpression zu verbessern.本研究旨在探讨HIF-1和Koktivatoren转录因子复合物的共定位，以及缺氧条件下促红细胞生成素（EPO）基因表达的变化，并对Zellen和Zellkernen进行定量韦尔登分析。HIF-1基因表达的局部化首先是通过检测基因表达水平来确定EPO基因的DNA调控元件。“远场光学显微镜”的研究结果表明，传统的光学显微镜可以有效地检测染色质和HIF-1-复合物韦尔登。通过2-Photonen angeregte FRET-Messungen对HIF-1组分进行共定位，并与“3D-2-Photonen Epifluorescence Spectral Precision Distance Microscopy”[SPDM]进行联合检测，以获得更好的检测结果。本文采用空间调制照明显微镜和荧光原位杂交技术，对EPO-Gen的激活和不激活状态进行了研究。 该项目的目的是进一步了解缺氧诱导的基因表达。因此，将进行在缺氧条件下在活细胞和固定的完整细胞核中转录因子复合物HIF-1和增加促红细胞生成素（EPO）基因表达的共激活剂的共定位的定量光学分析。光光学分析将被用来定位HIF-1组分在不同的细胞隔室和随后的共定位在EPO基因的调控DNA元件在一个确定的氧张力。此外，新的远场光学显微镜方法超出了传统的光学分辨率的限制，应应用于确定活性染色质和活性HIF-1复合物的共定位。对于HIF-1组分的共定位，将结合用于测定几nm范围内的小距离的双光子激发FRET测量和用于测量较大距离的三维[3D]双光子落射荧光光谱精密距离显微镜[SPDM]。通过空间调制照明[SMI]显微镜，使用荧光原位杂交（FISH）和EPO基因区特异性探针，测定含有活性和非活性状态EPO基因的染色质复合物的大小（直径）。

Ziel des Projektes ist es, das Verständnis der hypoxieinduzierten Genexpression zu verbessern. Dazu soll die Kolokalisation des Transkriptionsfaktorkomplexes HIF-1 und der Koaktivatoren, die die Expression des Gens für Erythropoietin (EPO) unter hypoxischen Bedingungen steigern, in lebenden Zellen und intakten Zellkernen quantitativ optisch analysiert werden. Die lichtmikroskopische Lokalisation der Komponenten von HIF-1 erfolgt erst in den verschiedenen zellulären Kompartimenten und anschließend an regulatorischen DNA-Elementen des EPO-Gens unter einem definierten Sauerstoffdruck. Zudem sollen mithilfe der "Far Field Light Microscopy" jenseits der Grenzen der konventionellen optischen Auflösung aktives Chromatin und der aktive HIF-1-Komplex kolokalisiert werden. Die Kolokalisation der HIF-1 Komponenten durch 2-Photonen angeregte FRET-Messungen, um Abstände von wenigen nm zu bestimmen, wird kombiniert mit der "3D-2-Photonen Epifluorescence Spectral Precision Distance Microscopy" [SPDM], um größere Abstände zu bestimmen. Die Größe des Chromatinkomplexes, der das EPO-Gen in seinem aktiven und inaktiven Status beherbergt, wird mit "Spatially Modulated Illumination" Mikroskopie und Fluorescence in situ Hybridisierung mit EPO-Gen spezifischen Sonden bestimmt. Summary: The aim of the project is to gain further insight into hypoxia-induced gene expression. Hence, quantitative optical analyis of the co-localization of the transcription factor complex HIF-1 and co-activators increasing expression of the erythropoietin (EPO) gene under hypoxic conditions in living cells and fixed intact nuclei will be performed. Light optical analysis will be used to localize HIF-1 components in different cellular compartments and subsequent co-localization on regulatory DNA elements of the EPO gene under a defined oxygen tension. Furthermore, new Far Field Light Microscopy approaches beyond the limits of conventional optical resolution shall be applied to determine the colocalization of active chromatin and the active HIF-1 complex. For colocalization of HIF-1 components, Two-photon excitation FRET-measurements for the determination of small distances in the few nm range, and three-dimensional [3D] Two-photon epifluorescence Spectral Precision Distance Microscopy [SPDM] for the measurement of larger distances will be combined. The size (diameter) of the chromatin complex harboring the EPO gene in its active and inactive state will be determined by Spatially Modulated Illumination [SMI] microscopy, using Fluorescence in situ hybridization (FISH) with probes specific for the EPO gene region.