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东南大学邱海波团队揭示：细胞外囊泡介导的中性粒细胞反向跨内皮迁移对脓毒症病理进展的影响
Highlights
1. 炎症状态下的血管内皮细胞释放的EVs，促进中性粒细胞的rTEM。
2. EVs携带的KPNB1通过激活STAT1信号通路上调NE，导致JAM-C的降解，从而促进rTEM。
近日，“Advanced Science”（IF=14.3）上发表了一篇题为“Endothelial Cell-Derived Extracellular Vesicles Promote Aberrant Neutrophil Trafficking and Subsequent Remote Lung Injury“的文章。这篇文章探讨了脓毒症导致急性呼吸窘迫综合征的分子病理机制，特别是关注了血管内皮细胞释放的细胞外囊泡如何促进中性粒细胞的异常迁移并导致远端肺损伤。
研究背景介绍
脓毒症是一种由身体对感染的极端反应引起的危及生命的疾病，其特征是免疫系统的调节失衡，可能导致多器官功能衰竭和死亡。
急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种严重的肺部疾病，其特点是肺部炎症和液体积聚，导致呼吸困难和低氧血症。
反向跨内皮迁移（rTEM）是中性粒细胞在炎症组织中的一种特殊迁移方式，它们从组织间隙穿过内皮细胞返回血管腔内。
细胞外囊泡（EVs）细胞外囊泡是细胞释放的小型膜结构，能够携带多种生物活性分子，如蛋白质、RNA和DNA，参与细胞间的通讯。
研究思路分析
研究技术路线图
01rTEM PMNs的鉴定与表型特征
①对假手术或盲肠结扎穿刺（CLP）处理的小鼠肺组织进行scRNA-seq分析，通过UMAP聚类策略，将肺细胞分为15个离散的细胞群体。研究发现，CLP处理后小鼠肺中的PMN（多形核中性粒细胞）比例升高。
②根据已知的rTEM PMN表型标志物（ICAM1、CXCR4高表达和低CXCR1表达），识别出了三个主要的PMN亚群，其中rTEM PMN亚群在CLP处理后的小鼠肺中比例增加。且rTEM PMN亚群在炎症信号传导通路方面功能活化。此外，rTEM PMN在脓毒症肺中的活化标志物Cd11b表达升高，而Cd62l和Cxcr2表达降低，表明这些细胞处于活化状态。
③研究发现，与健康对照组相比，脓毒症患者血液中rTEM PMN比例升高。共聚焦活体显微镜证实在脓毒症小鼠模型中，rTEM现象在肺血管中的发生。流式细胞术分析显示，CLP处理后的小鼠血液和肺组织中PMN和rTEM PMN的比例增加，且rTEM PMN表现出更活化的表型。
02rTEM PMNs在肺损伤中的作用
①在体外进行细胞迁移实验，发现体外生成的rTEM PMN显示出活化表型，并且比正常PMN释放更多的ROS和具有更强的抗凋亡能力。而接受rTEM PMN处理的小鼠表现出明显的肺部损伤和炎症。表明，rTEM PMN在体内转移后倾向于散布到肺部，并在那里滞留，进而促进肺部损伤。
②RNA测序及GO分析发现，EVs的“载体”功能可能在rTEM PMN过程中发挥重要作用。CellChat解析显示CLP处理的小鼠肺部ECs与PMNs之间的相互作用数量和权重显著增强。从假手术和CLP小鼠中分离出血浆EVs，发现CLP小鼠的循环EVs总数增加。质谱分析进一步揭示了EVs中与中性粒细胞脱颗粒途径相关的蛋白显著富集。
03EVs在rTEM PMNs中的作用机制
①通过使用小鼠肺内皮细胞系和骨髓来源的中性粒细胞，发现LPS-EVs能逆转中性粒细胞迁移并改变其表面分子表达。而LPS-EVs被中性粒细胞摄取后，增加了肺部rTEM中性粒细胞的比例，诱导肺部炎症和损伤。而使用EV生物发生抑制剂GW4869预处理可减轻这些效应，减少中性粒细胞浸润，降低肺部炎症和病理变化，提高脓毒症小鼠生存率，改善肺部功能。
②在脓毒症小鼠模型中，LPS-EVs处理上调了中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）蛋白的表达，并减少了内皮细胞连接处的连接粘附分子-C（JAM-C）水平。使用NE抑制剂GW311618A可以减少rTEM中性粒细胞的比例并减轻JAM-C的降解。
③进一步研究发现，LPS-EVs携带的核转运蛋白β-1（KPNB1）可能通过激活信号转导和转录激活因子1（STAT1）来增强NE的表达，进而导致rTEM。通过KPNB1敲减的细胞系产生的EVs处理中性粒细胞，发现rTEM的比例显著降低，且相关分子表达发生变化。
04临床相关性与潜在治疗靶点
①对脓毒症患者血浆中EV的浓度检测发现，与健康对照组相比，无论是否伴有ARDS，脓毒症患者的总EV浓度显著升高。特别是，脓毒症患者的血浆中来自内皮细胞的EV（CD31+ EVs）的比例高于对照志愿者。
②此外，ARDS患者的血浆CD31+ EVs的浓度高于无ARDS的脓毒症患者，但两者之间没有显著差异。且脓毒症患者血浆中CD31+ EVs的浓度与rTEM PMN的比例呈正相关。与对照组相比，脓毒症患者血浆EV中KPNB1的蛋白表达显著增加。
图1. 脓毒症肺部的单细胞RNA测序分析揭示了具有功能性激活的独特rTEM PMN亚群
图2. rTEM PMNs的比例增加与脓毒症患者和脓毒症小鼠的疾病严重程度呈正相关
图3. rTEM PMNs的转移加剧了肺部损伤
图4. scRNA-seq分析揭示了脓毒症中ECs和PMNs之间的交流增强以及EC衍生EVs的升高
图5. EC衍生的EVs在体内将PMNs编程为rTEM PMN表型并引起远端肺损伤
图 6. LPS-EVs通过上调NE和随后的JAM-C降解来支持PMN rTEM
图7. 在脓毒症相关ARDS患者中，血浆EC衍生的EV增加
图8. 示意图显示在炎症条件下过量的EC衍生EVs促进PMN rTEM及其对远端肺炎症和损伤的潜在贡献
结论与讨论
本研究发现脓毒症诱导的ARDS中，EC释放的EVs通过富含的KPNB1促进中性粒细胞的rTEM，导致远端肺损伤。rTEM中性粒细胞在脓毒症患者血液中的比例升高，与疾病严重程度正相关。EVs的生物合成抑制剂GW4869能够减少肺部的中性粒细胞浸润，降低肺损伤，表明EC衍生的EVs是治疗脓毒症相关肺损伤的潜在靶点。
尽管已确定EC衍生的EVs在促进中性粒细胞rTEM中的作用，但仍需进一步研究EVs在不同器官中的具体功能和机制。此外，需要探索除ECs外其他细胞来源的EVs在rTEM中的作用。