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発光タグHiBiTの高機能化・多機能化を通した新規発生遺伝子解析手法の確立

通过发光标签HiBiT的高性能和多功能化建立新的发育基因分析方法

基本信息

批准号：
21K06202
负责人：
蒲池雄介
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kochi University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06202/
关键词：
タギング遺伝子タギング HiBiTタグ

项目摘要

モデル動物におけるゲノム編集技術を用いたノックアウトやノックインによる遺伝子機能の解明が進展しているが、タグの挿入のようなゲノム編集ラインの確立は時間を要するステップである。したがって、一つのペプチドタグを高機能化・多機能化できれば、実験目的ごとのノックインやノックアウトの必要性を低下させ、研究の迅速化につながることが期待される。本研究は、発光タグとして開発されたHiBiTの高機能化・多機能化を通して遺伝子機能の解析の高度化・迅速化をもたらす方法を開発し、これをゼブラフィッシュ胚発生過程における転写因子の研究へと応用することを目的として実施する。HiBiTタグは、NanoLucの２断片（HiBiTとLgBiT）の相補に基づく発光検出が可能なタグとして開発された11アミノ酸からなるペプチドタグであるが、両者は高い親和性で相互作用し得るため、アフィニティタグとしても利用できる可能性がある。一方、細胞内におけるタンパク質検出にナノボディが利用される場合が近年増加している。そこで、親和性が高いことが知られるALFAタグ-ナノボディ(NbALFA)の組み合わせとHiBiTタグとLgBiTの組み合わせの比較を行うことで、HiBiTとLgBiTの相互作用を利用するシステムの有効性を調べた。ALFAタグ-NbALFAの相互作用を利用したプロテインノックダウンが報告されていることから、HiBiTタグあるいはALFAタグを付加した緑色蛍光タンパク質GFP、F-boxを融合したLgBiTおよびF-boxを融合したNbALFAを用意した。それぞれの組合せをゼブラフィッシュ胚で発現させ、相互作用を通してGFPのタンパク質分解が生じるかを調べた。その結果、いずれの場合も両者の相互作用に依存したGFPの蛍光消失がほぼ同様に観察できたことから、HiBiTとLgBiTの相互作用はALFAタグ-NbALFと同様に利用できることが示唆された。この結果は、HiBiTタグが幅広いin vivo実験で利用可能なことを示唆する。

モデルAnimal におけるゲノムCompilation technology をいたノックアウトやノックインによる伝subfunction explainedが progress しているが、タグのINSERT のようなゲノムassemble ラインのEstablishment は时を要するステップである.したがって、一つのペプチドタグをHighly functional and multifunctional できれば、実験目ごとのノッThe necessity of クインやノックアウトの is low, and the rapid development of research is expected to be される. The purpose of this research is to develop high-performance and multi-functional HiBiT, and to improve and speed up the analysis of sub-functions.らす method を开発し、これをゼブラフィッシュEmbryonic growth process における転WRITING FACTOR'S RESEARCH へと応用することをpurpose として実时する. HiBiT タグは, NanoLuc の2 fragment (HiBiT とLgBiT) のphase complement にbase づく発光検出がpossible なタグとして开発された11アミノ acid acid からなるペプチドタグであるが、両人高的compatibility and interaction It's possible to use it, and it's possible to use it. On the one hand, the use of intracellular substances has increased in recent years.そこで、affinity が高いことが知られるALFAタグ-ナノボディ(NbALFA)の集团み合わせとHiBiTタグとL gBiT's combination and comparison, HiBiT's interaction and effectiveness, and HiBiT's interaction. ALFAタグ-NbALFAのInteraction Utilizationしたプロテインノックダウンがreportされていることから、HiBiTタグあるいはALF Aタグを富加したGreen 荍光タンパクquality GFP, F-boxをfusionしたLgBiTおよびF-boxをfusionしたNbALFAを意した.それぞれの Combination せをゼブラフィッシュEmbryo で発appears させ、Interaction を通してGFP のタンパク性 decomposition が生じるかを Adjustment べた.そのRESULT, いずれの occasion も両人のdependence したGFPの蛍光 disappears がほぼ同様に観看できたことから, HiBiT and LgBiT's interaction is ALFA's - NbALF's same 様にutilization is used to show the instigation.このRESULTSは、HiBiTタグが広いin vivo実験でUSE FUNCTIONAL POSSIBILITYなことをshows instigationする.