Molecular mechanism underlying secondary hyperparathyroidism in chronic kidney disease

慢性肾脏病继发性甲状旁腺功能亢进的分子机制

基本信息

批准号：
21K08561
负责人：
片岡浩介
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K08561/
关键词：
副甲状腺転写調節リン・カルシウム代謝

项目摘要

PTH遺伝子発現のビタミンDおよびFGF23による抑制の分子機構の解明を目指した。従来までに、線維芽細胞BHK21を用いて、PTH遺伝子エンハンサー・プロモーターを含むレポーターと、副甲状腺特異的な転写活性化因子Gata3-MafB-Gcm2、さらにビタミンD受容体VDRとそのパートナーRXRaを共発現させることによって、ビタミンDの濃度依存的に転写が抑制される実験系を構築していた。本実験系においては、多数の因子を同時に発現させなければならないので、導入した転写因子の発現量や挙動を調べる上で、それらの検出に問題があった。そこで、転写をドライヴするプロモーターの最適化、IRESを利用した多因子の同時発現、検出におけるタグの最適化（PTH転写調節とビタミンDによる抑制へ干渉しないことの確認）などを行った。これらの改良の結果、ビタミンD依存的な転写因子の挙動の変化を容易に観察できるようになった。また、この系を発展させて、FGF受容体FGFR1とその共受容体Klothoを共発現させることにより、培地に組換えFGF23タンパク質を添加することによって、PTH遺伝子の発現抑制をモニターできる系の構築を試みた。現在までのところ、おおむね成功したように見えているが、FGFR1のキナーゼ活性の依存性や、Klothoの必要性、添加するFGF23の濃度依存性などを検証中である。一方、副甲状腺機能抑制系の受容体のひとつであるKlothoの発現調節機構について、ゲノム配列の保存性を利用して、ヒトKlotho遺伝子の転写開始点近傍から上流約2.5 kbの範囲をクローニングし、レポータープラスミドを作成した。Gata3, MafB-Gcm2に加え、さらに関与する可能性のある転写因子の候補としてTbx1, Six1, Pax1, Eya1の発現プラスミドを構築し、転写活性を調べた。

我们旨在阐明维生素D和FGF23抑制PTH基因表达的分子机制。以前，成纤维细胞BHK21用于构建实验系统，通过共表达含有PTH基因增强子启动子的记者（甲状旁腺特异性转录激活剂GATA3-MAFB-GCM2），以浓度依赖的方式抑制转录，并抑制canteror vdra and and Vlitamin d Betsor vdrra and and and and and and and and and and and and Vly and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and uts dy and rxra。在这个实验系统中，必须同时表达许多因素，并且在检查引入转录因子的表达水平和行为时，发现它们存在问题。因此，我们执行了优化启动子，该启动子驱动转录，使用IRE的多因子共表达以及在检测中优化标签（确认它不会干扰PTH转录调节和抑制维生素D抑制）。由于这些改进，可以很容易地观察到维生素D依赖性转录因子的行为变化。此外，通过开发该系统，我们试图通过共表达FGF受体FGFR1及其共受体Klotho并将重组FGF23蛋白添加到培养基中来构建一个可以监测PTH基因表达抑制的系统。迄今为止，这似乎已经取得了成功，但是目前正在研究FGFR1激酶活性，对Klotho的需求以及FGF23的浓度依赖性的依赖性。另一方面，甲状旁腺功能抑制系统的受体之一克洛托的表达调节机制用于克隆人类klotho基因的转录起点附近的大约2.5 kb的范围，以创建一个记者质粒。 TBX1，SIX1，PAX1和EYA1的表达质粒被构造为除GATA3和MAFB-GCM2以外可能涉及的转录因子的候选物，并检查了转录活性。