Molecular mechanism underlying secondary hyperparathyroidism in chronic kidney disease

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PTH遺伝子発現のビタミンDおよびFGF23による抑制の分子機構の解明を目指した。従来までに、線維芽細胞BHK21を用いて、PTH遺伝子エンハンサー・プロモーターを含むレポーターと、副甲状腺特異的な転写活性化因子Gata3-MafB-Gcm2、さらにビタミンD受容体VDRとそのパートナーRXRaを共発現させることによって、ビタミンDの濃度依存的に転写が抑制される実験系を構築していた。本実験系においては、多数の因子を同時に発現させなければならないので、導入した転写因子の発現量や挙動を調べる上で、それらの検出に問題があった。そこで、転写をドライヴするプロモーターの最適化、IRESを利用した多因子の同時発現、検出におけるタグの最適化（PTH転写調節とビタミンDによる抑制へ干渉しないことの確認）などを行った。これらの改良の結果、ビタミンD依存的な転写因子の挙動の変化を容易に観察できるようになった。また、この系を発展させて、FGF受容体FGFR1とその共受容体Klothoを共発現させることにより、培地に組換えFGF23タンパク質を添加することによって、PTH遺伝子の発現抑制をモニターできる系の構築を試みた。現在までのところ、おおむね成功したように見えているが、FGFR1のキナーゼ活性の依存性や、Klothoの必要性、添加するFGF23の濃度依存性などを検証中である。一方、副甲状腺機能抑制系の受容体のひとつであるKlothoの発現調節機構について、ゲノム配列の保存性を利用して、ヒトKlotho遺伝子の転写開始点近傍から上流約2.5 kbの範囲をクローニングし、レポータープラスミドを作成した。Gata3, MafB-Gcm2に加え、さらに関与する可能性のある転写因子の候補としてTbx1, Six1, Pax1, Eya1の発現プラスミドを構築し、転写活性を調べた。