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Molecular mechanism of biological timer and effect of short peptide pri which regulates it in Drosophila

果蝇生物计时器的分子机制及短肽pri对其的调节作用

基本信息

批准号：
20K06668
负责人：
上田均
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

熱ショックでFlagタグ付きBlimp-1を誘導できるtransgeneを持たせたPri mutant前蛹に熱ショックを与え、Blimp-1を強制発現させたのち、Western blot法でFlagタグ抗体を用いてBlimp-1の消失の様子を観察することでpri mutantではBlimp-1の分解速度が低下することが確認された。これにより少なくともpri mutantで蛹化タイミングが遅延することはBlimp-1の分解速度が低下していることが原因となっていると考えられた。in situ hybridization法でpri mRNAの発現を観察したところ、前蛹期に脂肪体で発現していることが確認され、蛹化タイマーが存在する脂肪体でPriがタイマーの測定時間を決める要素になっていることが支持された。Flag tag付きPriおよびMyc tag付きFbxO11をGAL4コントロ―ル下で発現できるコンストラクを作成し、受精卵にinjectionすることでtransgenic fly系統をそれぞれ樹立した。さらに、熱ショックでGAL4を発現できるtransgeneを同時に持つ系統を交配によって樹立し、PriとFbxO11が直接結合するか検証する準備を整えた。FTZ-F1のアイソフォーム特異的な遺伝子領域のdouble strand RNAをGAL4コントロ―ル下で発現できるtransgeneのコンストラクトを作成し、injectionすることでFTZ-F1 をアイソフォーム特異的にknockdownできるRNAi系統を樹立した。この系統を用いて前胸腺で特異的にFTZ-F1のknockdownを行ったところ、幼虫致死になった。このことから前胸腺での特定のFTZ-F1アイソフォームの発現がショウジョウバエの後胚発生過程で重要であることが示唆された。

Western blot analysis of the disappearance of Blimp-1 in the presence of Flag-specific antibodies confirmed that the decomposition rate of Blimp-1 was low. The reason why the decomposition speed of Blimp-1 is so low is that it is not easy to change. In situ hybridization method, the expression of pri mRNA was detected in the fat body before pupae, and the detection time of Pri mRNA was determined. Flag tag Pri and Myc tag FbxO11 are found in the GAL4 channel. In addition, GAL4 was discovered and transgene was prepared for direct combination with Pri and FbxO11. FTZ-F1 has been successfully developed as a transgene knockdown RNAi system by creating and injecting a double-strand RNA in the GAL4 channel of FTZ-F1 's soft-gene-specific knockdown domain. This system uses the FTZ-F1 knockdown technique to kill larvae. The development of the specific FTZ-F1 complex in the anterior thymus is important in the development of the posterior embryo.