Molecular mechanism of biological timer and effect of short peptide pri which regulates it in Drosophila

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熱ショックでFlagタグ付きBlimp-1を誘導できるtransgeneを持たせたPri mutant前蛹に熱ショックを与え、Blimp-1を強制発現させたのち、Western blot法でFlagタグ抗体を用いてBlimp-1の消失の様子を観察することでpri mutantではBlimp-1の分解速度が低下することが確認された。これにより少なくともpri mutantで蛹化タイミングが遅延することはBlimp-1の分解速度が低下していることが原因となっていると考えられた。in situ hybridization法でpri mRNAの発現を観察したところ、前蛹期に脂肪体で発現していることが確認され、蛹化タイマーが存在する脂肪体でPriがタイマーの測定時間を決める要素になっていることが支持された。Flag tag付きPriおよびMyc tag付きFbxO11をGAL4コントロ―ル下で発現できるコンストラクを作成し、受精卵にinjectionすることでtransgenic fly系統をそれぞれ樹立した。さらに、熱ショックでGAL4を発現できるtransgeneを同時に持つ系統を交配によって樹立し、PriとFbxO11が直接結合するか検証する準備を整えた。FTZ-F1のアイソフォーム特異的な遺伝子領域のdouble strand RNAをGAL4コントロ―ル下で発現できるtransgeneのコンストラクトを作成し、injectionすることでFTZ-F1 をアイソフォーム特異的にknockdownできるRNAi系統を樹立した。この系統を用いて前胸腺で特異的にFTZ-F1のknockdownを行ったところ、幼虫致死になった。このことから前胸腺での特定のFTZ-F1アイソフォームの発現がショウジョウバエの後胚発生過程で重要であることが示唆された。