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高浸透圧のキナーゼ反応増強作用による環境ストレス応答の新奇制御機構

高渗激酶反应增强效应调节环境应激反应的新机制

基本信息

批准号：
21H02422
负责人：
舘林和夫
金额：
$ 11.15万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、酵母の高浸透圧応答性Hog1 MAPK経路の高浸透圧による細胞質局在キナーゼのリン酸化増強作用の仕組みを解析した。リン酸化増強の作用点として1)Pbs2-Hog1リン酸化、2) Ssk2-Pbs2リン酸化が存在するが、Pbs2は酵素、基質の両方の役割を持つ。さらに高浸透圧によるリン酸化増強は、特にPbs2の活性化ループ内のSer514（S514）、Thr518（T518）の一方のみがリン酸化されたモノリン酸化Pbs2によるHog1のリン酸化に必要であることから、リン酸化増強作用を理解する上で、同ループのリン酸化制御機構の解明が重要である。そこで未知だったPbs2の活性化ループの脱リン酸化機構を解析した。特異的リン酸化抗体及びPhos-tagバンドシフトアッセイ法を組み合わせてS514、T518のリン酸化を直接検出する系を初めて確立し、Hog1経路を負に制御する2C型ホスファターゼ群の欠失変異がPbs2脱リン酸化に与える影響を調べた。その結果、主としてPtc1がT518の脱リン酸化に働くこと、Ptc1、Ptc2、Ptc3、Ptc4がS514の脱リン酸化に重複して働くことがわかった。また高浸透圧刺激下でPbs2のS514、T518の両者をリン酸化するSsk2は、活性の弱い非刺激時にはT518のみしかリン酸化できないことを示し、高浸透圧増強の起こらない非刺激時において不適切なHog1のリン酸化・活性化が抑制される仕組みを明らかにした。上記に加えて、リン酸化増強を模倣する可能性のあるPbs2の超活性型変異体を単離・解析した結果、それらが基質としての性質変化を示唆する活性化ループ内のリン酸化が亢進するタイプの変異であることがわかった。さらにSsk2のリン酸化活性に重要な自己リン酸化候補部位を同定した。

In this study, we analyzed the mechanism of intracellular acidification enhancement in high osmotic pressure Hog1 MAPK pathway of yeast. The action points of acidification enhancement are: 1) Pbs2-Hog1 acidification; 2) Ssk2-Pbs2 acidification; 2) Pbs2 enzyme; 3) substrate hydrolysis. In addition, it is important to understand the mechanism of acidification enhancement in high permeability, especially Ser514 (S514) and Thr518 (T518) in the activation of Pbs2 and Hog1. The activation and acidification mechanism of Pbs2 were analyzed. The combination of specific RPA antibodies and Phos-tag assays directly detects the presence of RPA S514 and T518. The system is initially established, and the Hog1 pathway is negatively controlled. The 2C type RPA group is poorly differentiated and the effects of Pbs2 RPA are modulated. Results: Ptc1, Ptc2, Ptc3, Ptc4, S514, Ptc1, Ptc2, Ptc3, Ptc4 Under high osmotic pressure stimulation, Pbs2 S514 and T518 were acidified, Ssk2 activity was weak, T518 activity was weak, and Hog1 activity was inhibited under high osmotic pressure stimulation. The results of the analysis of the hyperactive variant of Pbs2 and the results of the analysis of the properties of the matrix are as follows: The activity of Ssk2 is important for the identification of candidate sites for acidification.