高浸透圧のキナーゼ反応増強作用による環境ストレス応答の新奇制御機構

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本研究では、酵母の高浸透圧応答性Hog1 MAPK経路の高浸透圧による細胞質局在キナーゼのリン酸化増強作用の仕組みを解析した。リン酸化増強の作用点として1)Pbs2-Hog1リン酸化、2) Ssk2-Pbs2リン酸化が存在するが、Pbs2は酵素、基質の両方の役割を持つ。さらに高浸透圧によるリン酸化増強は、特にPbs2の活性化ループ内のSer514（S514）、Thr518（T518）の一方のみがリン酸化されたモノリン酸化Pbs2によるHog1のリン酸化に必要であることから、リン酸化増強作用を理解する上で、同ループのリン酸化制御機構の解明が重要である。そこで未知だったPbs2の活性化ループの脱リン酸化機構を解析した。特異的リン酸化抗体及びPhos-tagバンドシフトアッセイ法を組み合わせてS514、T518のリン酸化を直接検出する系を初めて確立し、Hog1経路を負に制御する2C型ホスファターゼ群の欠失変異がPbs2脱リン酸化に与える影響を調べた。その結果、主としてPtc1がT518の脱リン酸化に働くこと、Ptc1、Ptc2、Ptc3、Ptc4がS514の脱リン酸化に重複して働くことがわかった。また高浸透圧刺激下でPbs2のS514、T518の両者をリン酸化するSsk2は、活性の弱い非刺激時にはT518のみしかリン酸化できないことを示し、高浸透圧増強の起こらない非刺激時において不適切なHog1のリン酸化・活性化が抑制される仕組みを明らかにした。上記に加えて、リン酸化増強を模倣する可能性のあるPbs2の超活性型変異体を単離・解析した結果、それらが基質としての性質変化を示唆する活性化ループ内のリン酸化が亢進するタイプの変異であることがわかった。さらにSsk2のリン酸化活性に重要な自己リン酸化候補部位を同定した。