Pathologic analysis of age-related diseases based on individual quantification of polyubiquitin chain forms

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ユビキチン－プロテアソーム系やオートファジー系が担う不要なタンパク質の合目的分解は、真核生物の細胞内タンパク質の恒常性（プロテオスタシス）の維持に不可欠である。近年、老化に伴って、両分解系の機能が低下し、加齢性疾患の発症リスクとなる可能性が多数報告されている。そこで本研究では、両系の分解シグナルであるポリユビキチン鎖に着目し、プロテオスタシスに基づく老化マーカーとしての意義を検討する。ポリユビキチン鎖を認識するFK2抗体を固相と検出に用いたFK2-FK2 sandwich ELISAは、3種類（K48鎖，K64鎖，M1鎖）の各ポリユビキチン長鎖を区別なく検出し、測定値は全鎖総量に対応することが明確となった。各鎖型に特異的な測定系を確立するため、市販の各鎖（K48鎖，K64鎖，M1鎖）特異抗体を検出に用いた様々なFK2-各抗体 sandwich ELISAを検証したが、どの組み合わせも実用レベルの感度や特異性を示さなかった。ヒト正常二倍体線維芽細胞TIG-1を用いた検討では、細胞集団倍加数（PDL）62を超えると同細胞の倍加速度が遅延し、その後、肥大扁平化やSA-β-galの発現などの複製老化の特徴を示したため、PDL 24～34群、43～56群、62～72群の細胞から、1% Triton X-100可溶化画分とその不溶成分を2% SDSで可溶化した画分を調製し、分画ごとに各群のポリユビキチン鎖量を比較した。しかし、予想に反して、各平均値に有意差はなく、細胞老化の影響を見出せなかった。TIG-1細胞の老化とプロテアソーム活性の関係についても同様の結果を得ているが、実験手法の見直しなどの再検証を予定している。