Lys63結合型ポリユビキチン鎖を検出する分子プローブの開発とその応用

Lys63连接的多聚泛素链分子探针的开发及其应用

基本信息

批准号：
21657031
负责人：
駒田雅之
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

脱ユビキチン(Ub)化酵素AMSHは、Lys63結合型ポリUb鎖を選択的に切断する酵素である。我々はこれまでに、AMSHの触媒ドメインの酵素活性欠失変異体がLys63結合型Ub鎖と安定な複合体を形成することを具出している。本研究では、酵素活性を欠失させたAMSHの触媒ドメインをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として大腸菌に発現させ、グルタチオン・ビーズを用いて精製した。そして、このGST融合タンパク質をLys63結合型Ub鎖を特異的に認識する分子プローブとして利用することができないか、以下の2つの実験により検討した。1.固定しpermeabilizeしたHeLa細胞をAMSH-GST融合タンパク質とインキュベートし、細胞内のLys63結合型Ub化されたタンパク質と結合させた。未結合のGST融合タンパク質を除いた後、抗GST抗体による免疫染色でLys63結合型Ub化された細胞内タンパク質の局在の同定を試みた。しかし、コントロール細胞と比べて強く染色される細胞内部位を見出すことはできなかった。用いるGST融合タンパク質の濃度やインキュベーションの温度、時間などの条件を細かく検討する必要が示唆された。2.精製したAMSH-GST融合タンパク質をグルタチオン・ビーズにコンジュゲートし、HeLa細胞のライセートを加えてインキュベートした。ビースを洗浄後、結合タンパク質をSDSで溶出し、電気泳動後、抗Ub抗体でイムノブロッティングした。その結果、Ub化タンパク質のスメアーが検出された。このスメアーは、コントロールのGSTタンパク質によってはプルダウンされなかった。AMSH触媒ドメインはLys63結合型Ub鎖に特異的に結合することから、このドメインがHeLa細胞中でLys63結合型Ub化されたタンパク質をプルダウンできることが示唆された。引き続き、この系をスケールアップして大量のLys63結合型Ub化タンパク質を調製し、プロテオーム解析によりそれらの網羅的同定を試みたい。

去泛素化（UB）酶AMSH是一种选择性切割Lys63连接的多蛋白链的酶。迄今为止，我们已经规定，AMSH催化结构域中的酶活性缺失突变体形成了与Lys63连接UB链的稳定复合物。在这项研究中，AMSH的催化结构域（曾缺乏酶活性）在大肠杆菌中以谷胱甘肽S-转移酶（GST）（GST）为融合蛋白，并使用谷胱甘肽珠纯化。研究了以下两个实验，是否不能将这种GST融合蛋白用作专门识别Lys63连接UB链的分子探针。 1。固定和透化的HeLa细胞与AMSH-GST融合蛋白孵育，并结合到细胞内Lys63连接的尿液中。除去未结合的GST融合蛋白后，我们试图通过用抗GST抗体进行免疫染色来鉴定Lys63结合的尿液内细胞内蛋白的定位。但是，我们找不到比对照细胞更强烈染色的细胞内部位。已经提出，应仔细考虑使用GST融合蛋白的浓度，温度和孵育时间。 2。将纯化的AMSH-GST融合蛋白结合到谷胱甘肽珠，并添加HeLa细胞以孵育。洗涤贝斯后，用SDS，电泳洗脱结合的蛋白质，并用抗UB抗体进行免疫印迹。结果，检测到UB形成蛋白的涂片。对照GST蛋白没有将此涂片拉下。 AMSH催化结构域特异性结合了LYS63结合的UB链，表明该域可以在HeLa细胞中拉下Lys63结合的尿素。我们将继续扩展该系统，以准备大量富含UB UB的蛋白质，并尝试通过蛋白质组学分析全面识别它们。