Lys63結合型ポリユビキチン鎖を検出する分子プローブの開発とその応用

Lys63连接的多聚泛素链分子探针的开发及其应用

• 批准号: 21657031
• 负责人: 駒田 雅之
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2010
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21657031/
• 关键词: ユビキチン; 脱ユビキチン化酵素; タンパク質分解; 分子プローブ; 癌; 酵素; 細胞・組織; シグナル伝達; タンパク質

脱ユビキチン(Ub)化酵素AMSHは、Lys63結合型ポリUb鎖を選択的に切断する酵素である。我々はこれまでに、AMSHの触媒ドメインの酵素活性欠失変異体がLys63結合型Ub鎖と安定な複合体を形成することを具出している。本研究では、酵素活性を欠失させたAMSHの触媒ドメインをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として大腸菌に発現させ、グルタチオン・ビーズを用いて精製した。そして、このGST融合タンパク質をLys63結合型Ub鎖を特異的に認識する分子プローブとして利用することができないか、以下の2つの実験により検討した。1.固定しpermeabilizeしたHeLa細胞をAMSH-GST融合タンパク質とインキュベートし、細胞内のLys63結合型Ub化されたタンパク質と結合させた。未結合のGST融合タンパク質を除いた後、抗GST抗体による免疫染色でLys63結合型Ub化された細胞内タンパク質の局在の同定を試みた。しかし、コントロール細胞と比べて強く染色される細胞内部位を見出すことはできなかった。用いるGST融合タンパク質の濃度やインキュベーションの温度、時間などの条件を細かく検討する必要が示唆された。2.精製したAMSH-GST融合タンパク質をグルタチオン・ビーズにコンジュゲートし、HeLa細胞のライセートを加えてインキュベートした。ビースを洗浄後、結合タンパク質をSDSで溶出し、電気泳動後、抗Ub抗体でイムノブロッティングした。その結果、Ub化タンパク質のスメアーが検出された。このスメアーは、コントロールのGSTタンパク質によってはプルダウンされなかった。AMSH触媒ドメインはLys63結合型Ub鎖に特異的に結合することから、このドメインがHeLa細胞中でLys63結合型Ub化されたタンパク質をプルダウンできることが示唆された。引き続き、この系をスケールアップして大量のLys63結合型Ub化タンパク質を調製し、プロテオーム解析によりそれらの網羅的同定を試みたい。

The enzyme AMSH binds to Lys63 and the enzyme Ub binds to Lys63. The enzyme activity of AMSH was decreased in the presence of Lys63-conjugated Ub-lock and stable complexes. In this study, the enzyme activity of AMSH was reduced, and the enzyme activity of AMSH was reduced. The enzyme activity of GST was reduced, and the enzyme activity of GST was reduced. The GST-fusion protein is characterized by Lys63-binding Ub-lock, which is used for molecular identification. 1. Immobilization permeabilizes HeLa cells and Lys63-binding proteins. After removal of the unconjugated GST fusion protein, immunostaining with anti-GST antibodies was performed to determine the presence of Lys63-binding Ub-like proteins in the cytoplasm. The cells were stained strongly and the intracellular sites were observed. The concentration, temperature, time and other conditions of GST fusion protein are discussed in detail. 2. The AMSH-GST fusion is refined and the quality of the product is improved. After washing, binding, SDS dissolution, electrophoresis, anti-Ub antibody dissolution The results of the test, Ub test, test and test were analyzed. This is the first time I've ever seen a woman. AMSH catalyzer Lys63-binding Ub-lock specific binding in HeLa cells. A large number of Lys63-bound Ub-type compounds were synthesized and analyzed.

项目成果

Balanced ubiquitylation and deubiquitylation regulate Frizzled degradation and cellular responsiveness to Wingless/Wnt.

平衡的泛素化和去泛素化调节卷曲降解和细胞对 Wingless/Wnt 的反应。

• 发表时间: 2009
• 作者: Kuroha K.;Horiguchi N.;Aiba H.;Inada T.;駒田雅之;饗場弘二;伝田公紀;饗場弘二;向井明子
• 通讯作者: 向井明子

核小体の機能のユビキチンダイナミクスによる制御

泛素动力学控制核仁功能

• 发表时间: 2009
• 期刊: 生体の科学 60
• 作者: Ohno;N.;駒田雅之
• 通讯作者: 駒田雅之

Nucleophosmin/B23 Regulates Ubiquitin Dynamics in Nucleoli by Recruiting Deubiquitylating Enzyme USP36

• DOI: 10.1074/jbc.m109.037218
• 发表时间: 2009-10-09
• 期刊: JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
• 影响因子: 4.8
• 作者: Endo, Akinori;Kitamura, Naomi;Komada, Masayuki
• 通讯作者: Komada, Masayuki

ANKRD13 family of ubiquitin-binding proteins are possibly involved in endocytosis of epidermal growth factor receptor

泛素结合蛋白 ANKRD13 家族可能参与表皮生长因子受体的内吞作用

• 发表时间: 2010
• 作者: Ikeda;Y.;Yagi;M.;Morita;T.;Aiba;H.;丹野秀崇
• 通讯作者: 丹野秀崇

Balanced ubiquitylation and deubiquitylation of Frizzled regulate cellular responsiveness to Wg/Wnt

• DOI: 10.1038/emboj.2010.100
• 发表时间: 2010-07-07
• 期刊: EMBO JOURNAL
• 影响因子: 11.4
• 作者: Mukai, Akiko;Yamamoto-Hino, Miki;Goto, Satoshi
• 通讯作者: Goto, Satoshi