1細胞リン酸化プロテオミクスによる細胞分化解析

本研究では光シート顕微鏡 (PISA顕微鏡)による1分子観察をベースとした1細胞リン酸化プロテオミクス解析システムを開発し、中胚葉分化における1細胞リン酸化プロテオーム変化を捉えることを目的とする。2022年度はシステム開発に注力し、(1)ハイスループットな1細胞サンプル調製を可能にする微小液滴内抗体反応系の確立、(2)マイクロウェルゲルを用いた電気泳動分離、(3)光シート顕微鏡を用いた1分子イメージングと画像解析による超高感度定量の3つの技術要素に分割して進めた。しかし(1)(2)において、当初予定していたマイクロ流路デバイスを用いた液滴内抗体反応は抗体ビーズと一細胞の同時捕捉の効率が低く、またマイクロウェルゲルもサンプルロード時のビーズのロスが大きな問題となった。そこで液滴内反応からマルチウェルプレートベースの一細胞抗体反応に切り替え、電気泳動システムを改良することにより、スループット性を担保したままロスの少ない解析が見込めるようになった。この際使用する抗体ビーズはNHS活性化ビーズへ抗体をカップリングによって作製し、使用抗体の検討が完了している。(3)については泳動後のゲルを、ビーズ位置をもとに自動的に蛍光観察する顕微鏡システムを構築し、画像解析プログラムの開発にも着手した。また2023年度に予定している細胞分化実験に向けて、iPS細胞の中胚葉分化の予備実験を行い、実験系を確立した。

本研究では光シート顕微鏡 (PISA顕微鏡)による1分子観察をベースとした1細胞リン酸化プロテオミクス解析システムを開発し、中胚葉分化における1細胞リン酸化プロテオーム変化を捉えることを目的とする。2022年度はシステム開発に注力し、(1)ハイスループットな1細胞サンプル調製を可能にする微小液滴内抗体反応系の確立、(2)マイクロウェルゲルを用いた電気泳動分離、(3)光シート顕微鏡を用いた1分子イメージングと画像解析による超高感度定量の3つの技術要素に分割して進めた。しかし(1)(2)において、当初予定していたマイクロ流路デバイスを用いた液滴内抗体反応は抗体ビーズと一細胞の同時捕捉の効率が低く、またマイクロウェルゲルもサンプルロード時のビーズのロスが大きな問題となった。そこで液滴内反応からマルチウェルプレートベースの一細胞抗体反応に切り替え、電気泳動システムを改良することにより、スループット性を担保したままロスの少ない解析が見込めるようになった。この際使用する抗体ビーズはNHS活性化ビーズへ抗体をカップリングによって作製し、使用抗体の検討が完了している。(3)については泳動後のゲルを、ビーズ位置をもとに自動的に蛍光観察する顕微鏡システムを構築し、画像解析プログラムの開発にも着手した。また2023年度に予定している細胞分化実験に向けて、iPS細胞の中胚葉分化の予備実験を行い、実験系を確立した。