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N-グリコシル化糖蛋白質合成に関与する細胞周期依存的制御機構

N-糖基化糖蛋白合成中涉及的细胞周期依赖性控制机制

基本信息

批准号：
09780555
负责人：
福島慶子
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Sasaki Institute
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は同調したラット3Y1細胞を用いて、N-結合型糖鎖の生合成の制御について細胞周期依存性を含めた解析を行うことを目的としている。これまでに3Y1細胞の同調培養は接触阻止によりG_0期に移行するという性質を利用して行い、オリゴ糖・脂質中間体生成量及びその合成酵素活性量がG_1/S期に厳密に制御されていることを明らかにしてきた(J.Biochem.121,415-418,1997)。さらに、小胞体におけるオリゴ糖・脂質中間体合成のみならず、ゴルジ体に存在する糖転移酵体中でN-アセチルグルコサミン転移酵素I及びガラクトース転移酵素活性もまたG_1/S期に制御されていることを明らかにした。N-アセチルグルコサミン転移酵素Iについてはクローニングも為され、アミノ酸一次構造も判明していることから、リコンビナントを作製してポリクローナル抗体を得た。作製した抗体を用いてWestern blotting法により蛋白質発現レベルを調べたところ、酵素活性量と一致していることを確認した。さらに、接触阻止法による同調培養ではS期からG_2/M期に至っては同調が不十分に成らざるを得ないため、血清飢餓によりG_0期に移行した3Y1細胞をDNA合成阻害剤アフィジコリンを用いてG_1/S境界期に停止させ、G_2期、M期の詳細な解析を試みた。その結果、血清飢餓によるG_0状態の3Y1細胞は接触阻止によりG_0期に静止した3Y1細胞と異なり、オリゴ糖・脂質中間体合成量も各種酵素活性量も低下していないことが判明した。今後はN-結合型糖鎖合成開始のシグナルと接触阻止解除による増殖開始のシグナルとどのように関わりがあるのかを明らかにしていきたいと考えている。

In this study, the regulation of N-linked glycoclock production in 3Y1 cells was studied, including cell cycle dependence. The isochronous culture of 3Y1 cells was characterized by the inhibition of G_0 phase migration, the utilization of glucose, lipid intermediate production and the activity of synthetic enzymes in G_1/S phase (J. Biochem. 121, 415 - 418, 1997). The N-terminal enzyme I and the G1/S phase of the enzyme activity in the glycosyl-lipid intermediate synthesis process are regulated by the presence of the enzyme in the cytosol. The N-type enzyme I is used to identify the primary structure of N-type enzyme and to control the N-type enzyme. Western blotting was used to determine protein expression and enzyme activity. A detailed analysis of DNA synthesis inhibition in G_1/S phase, G_2 phase and M phase was conducted by using the contact inhibition method. As a result, the serum starvation of 3Y1 cells in G_0 phase resulted in decreased activity of various enzymes in 3Y1 cells in G_0 phase. In the future, the synthesis of N-linked glycans will be initiated and the contact will be prevented.