血管内皮細胞の傷害性刺激に伴って発現量が増加する新規遺伝子産物RTPの機能探索

新型基因产物RTP的功能探索，其表达水平随血管内皮细胞的毒性刺激而增加

• 批准号: 09780590
• 负责人: 小亀 浩市
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: National Cardiovascular Center Research Institute
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09780590/
• 关键词: 血管内皮細胞; ホモシステイン; リゾフォスファチジルコリン; 血栓症; 動脈硬化; 遺伝子発現; RTP; 細胞傷害

動脈硬化や血栓症には、血管内皮傷害が大きく関与している。最近我々は、ヒト血管内皮細胞において、内皮傷害誘導物質として知られるホモシステインと動脈硬化促進物質として知られるリゾフォスファチジルコリンで共通に発現誘導される未知遺伝子1種を発見した。この遺伝子は新規蛋白質(RTPと命名)をコードしているが、その生理機能は不明である。そこで本研究では、機能解明を最終目的として設定し、RTPの生物学的諸性質を解析した。(1) RTP特異的抗体の作成とそれを用いた解祈まず、大腸菌に発現させたRTP-GST融合蛋白質でウサギを免疫し、RTP特異的抗体を作成した。ウェスタンブロット解析を行った結果、RTPは約47kDa蛋白質であり、ホモシステイン刺激した細胞での発現量増加が確認された。さらに、RTPは培養細胞の細胞質に局在することが判明した。この存在様式は細胞の刺激受容に依存せず、RTPは恒常的に細胞質全体に分布することが示唆された。(2) RTPのリン酸化抗体を用いた解析から、RTPはリン酸化されていることを示唆するデータを得た。これを検証し、プロテインキナーゼAがRTPを生理的基質とすること、他のキナーゼも関与することを明らかにした。(3) RTP相互作用蛋白質の探索RTPと相互作用する蛋白質を探索するため、Yeast 2-Hybrid Systemを行った。RTP発現量の多い組織である腎臓のcDNAライブラリー1.1×10^7クローンをスクリーニングした結果、1陽性クローンが得られた。現在、その解析を進めている。(4) RTP発現と病態との関連免疫組織化学的解析から、RTPは腎臓の近位尿細管や小腸絨毛で著しく発現していることがわかった。そこで、種々の病態を示す腎臓を正常腎臓と比較し、病変悪化に伴ってRTP量が増加することを見出した。 以上の成果から、未だRTPの機能解明という目標には達していないものの、RTPに関する多くの貴重な知見が得られた。なお、本研究の一部を記述した論文をJ.Biol.Chem.誌に投稿し、現在再審査を受けているところである。

Arterial sclerosis, thrombosis, vascular endothelial damage, and other major issues. Recently, we have discovered an unknown gene that can induce vascular endothelial cell injury and atherosclerosis. The protein (RTP name) of this gene is unknown and its physiological function is unknown. The purpose of this study is to clarify the biological properties of RTP. (1)RTP-GST fusion protein is produced in the presence of E. coli, and RTP-specific antibodies are produced. As a result of the analysis of RTP, it was confirmed that RTP was about 47kDa protein and that the amount of RTP stimulated cells increased. In addition, RTP can be used to identify the cytoplasmic structure of cultured cells. The existence of this pattern depends on the cell's response to stimuli, and RTP is constantly distributed throughout the cytoplasm. (2)The RTP acidification antibody was used to analyze the RTP acidification and the data was obtained to demonstrate the RTP acidification. This is the first time I've ever seen A person who's been in a relationship with someone who's been in a relationship with someone else. (3)Exploring RTP Interaction Proteins Exploring RTP Interaction Proteins Yeast 2-Hybrid System The amount of RTP detected in multiple tissues was 1.1×10^7 clicks from the kidney cDNA library, and 1 positive click was obtained. Now, the analysis of the company into the middle of the year. (4)Immunohistochemical analysis of RTP findings and pathologies. RTP findings in proximal urinary tubule and small intestinal villi. The increase in RTP was observed in patients with renal failure. The above achievements are not divided into RTP functions, but the purpose of RTP is to achieve the goal of RTP and to realize the valuable knowledge of RTP. A part of this study is described in the journal J. Biol.Chem.

项目成果

小亀浩市: "血管内皮傷害に伴う遺伝子発現の変化." 血液アゴラ. 4. 59-70 (1997)

Hiroshi Ogame：“与血管内皮损伤相关的基因表达变化。”Blood Agora。 4. 59-70 (1997)

Koichi Kokame: "Nonradioactive differential display cloning of genes induced by homocysteine in vascular endothelial cells." Methods. 16(4). 434-443 (1998)

Koichi Kokame：“血管内皮细胞中同型半胱氨酸诱导的基因的非放射性差异显示克隆。”

小亀浩市: "TAFI活性化とトロンボモジュリンのドメイン構造." 日本血栓止血学会誌. 9(6). 445-450 (1998)

Hiroshi Ogame：“血栓调节蛋白的 TAFI 激活和结构域”。日本血栓和止血学会杂志 9(6)。

Naoaki Sato: "Lysophosphatidylcholine decreases the synthesis of tissue factor pathway inhibitor in human umbilical vein endothelial cells." Thromb.Haemostas.79(1). 217-221 (1998)

Naoaki Sato：“溶血磷脂酰胆碱减少人脐静脉内皮细胞中组织因子途径抑制剂的合成。”

宮田敏行: "関西血栓フォーラム「血小板血栓形成の分子機構」" ライフサイエンス出版, 253 (1997)

宫田敏之：《关西血栓论坛“血小板血栓形成的分子机制》生命科学出版社，253（1997）