修飾オリゴヌクレオチドを用いたT4エンドヌクレア-ゼVと基質の相互作用の解析

点击翻译按钮获取中文摘要

チミンダイマ-誘導体(酵素反応の際に選択的に引き抜かれる5'側チミジンの糖部2'位の水素をフッ素に置換した基質)は以下のようにして得た。まず、2'位にフッ素原子を導入したチミジン(2'ーフルオロT)を合成し、5'ー水酸基を保護した後、3'ーホスホアミダイト体とした。2'ーフルオロTを含むドデカデオキシリボヌクレオチド(dGCACGT^*TGCACG、T^*:2'ーフルオロT)を固相法で合成した後、紫外線を照射してチミンダイマ-を形成させた。相補鎖d12mer(dCGTGCAACGTGC)とハイブリダイズさせて2本鎖とした後、T4エンドヌクレア-ゼVの基質として用いた。フィルタ-バインディングアッセイにより酵素ー基質複合体の解離定数(Kd)を求めると、通常のチミンダイマ-を含む基質を用いた場合にはKd=1.6×10^<ー8>M、2'ーフルオロ体を含む基質誘導体ではKd=3.3×10^<ー8>Mとなり、酵素との結合に関してはほとんど同じであることがわかった。また、酵素の基質切断反応について調べると、2'ーフルオロ体を含む基質誘導体では全く切断がみられなかった。以上の結果から、2'ーフルオロ体を含む基質誘導体は、T4エンドヌクレア-ゼVにより認識されるが、鎖の切断を受けない基質となりうることを見いだした。この基質誘導体は、これまでに得られていないT4エンドヌクレア-ゼVー基質複合体結晶のX線構造解析に応用できるものと考えられる。