巨大タンパク質HERC2の機能解析

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昨年度に引き続き、HERC2全長cDNAのクローニングを行った。マウスHERC2は3個のRLDドメインと1個のHECTドメインを持つ分子量約500Kのタンパク質で、HERC2をコードするcDNAは約15kbに及ぶ。HERC2タンパク質のドメイン構造と、サブクローニングに使用可能な制限酵素配列を基にcDNAを5つのユニットに分け、各ユニットの発現ベクターをデザインした。クローニングの際に使用するEcoRI、XhoIの制限酵素サイトはHERC2のcDNA内に3カ所あるため、これらはアミノ酸置換を起こさないように配列を変えて制限酵素で切断されないようデザインした。マウス脳よりmRNAを調製し、逆転写酵素によりcDNAを合成した。このcDNAを鋳型として、5つのユニットに対応するHERC2断片のcDNAをPCRで増幅してpcDNA3ベクターにクローニングし、シークエンス解析によりcDNAの塩基配列にアミノ酸置換を引き起こす変異が無いことを確認した。その後通常の分子生物学的手法で5つのユニットを順次つないで行くことにより、全長及び各種のHERC2欠失変異体のcDNAを発現ベクターにクローニングすることができた。マウス組織でHERC2タンパク質の発現を調べた結果、心筋や骨格筋での発現量は低いが、HERC2はすべての組織で発現していることが明らかになった。また、ヒト及びマウスの培養細胞で同様にHERC2の発現を調べた結果、すべての細胞で発現していることが明らかになり、HERC2タンパク質は細胞の活動に重要な機能を持つことが示唆された。