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巨大タンパク質HERC2の機能解析

巨蛋白HERC2的功能分析

基本信息

批准号：
18659017
负责人：
内藤幹彦
金额：
$ 2.11万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18659017/
关键词：
HERC2 Pradar-Willi症候群 HECTドメイン

项目摘要

昨年度に引き続き、HERC2全長cDNAのクローニングを行った。マウスHERC2は3個のRLDドメインと1個のHECTドメインを持つ分子量約500Kのタンパク質で、HERC2をコードするcDNAは約15kbに及ぶ。HERC2タンパク質のドメイン構造と、サブクローニングに使用可能な制限酵素配列を基にcDNAを5つのユニットに分け、各ユニットの発現ベクターをデザインした。クローニングの際に使用するEcoRI、XhoIの制限酵素サイトはHERC2のcDNA内に3カ所あるため、これらはアミノ酸置換を起こさないように配列を変えて制限酵素で切断されないようデザインした。マウス脳よりmRNAを調製し、逆転写酵素によりcDNAを合成した。このcDNAを鋳型として、5つのユニットに対応するHERC2断片のcDNAをPCRで増幅してpcDNA3ベクターにクローニングし、シークエンス解析によりcDNAの塩基配列にアミノ酸置換を引き起こす変異が無いことを確認した。その後通常の分子生物学的手法で5つのユニットを順次つないで行くことにより、全長及び各種のHERC2欠失変異体のcDNAを発現ベクターにクローニングすることができた。マウス組織でHERC2タンパク質の発現を調べた結果、心筋や骨格筋での発現量は低いが、HERC2はすべての組織で発現していることが明らかになった。また、ヒト及びマウスの培養細胞で同様にHERC2の発現を調べた結果、すべての細胞で発現していることが明らかになり、HERC2タンパク質は細胞の活動に重要な機能を持つことが示唆された。

Last year, the full-length cDNA and HERC2 were introduced. The molecular weights of HERC2 and HERC2 were about 500K and 500K, respectively, and the molecular weights of HECT and cDNA were about 500K and 15kb, respectively. In the HERC2 system, you can use the possible restriction enzymes to match the basic cDNA 5 components, and each component will show that the restriction enzymes are not available. The restriction enzyme was made by using EcoRI, XhoI, and so on. The restriction enzyme was cut through the cut-off of the enzyme, which was used in HERC2 cDNA. The enzyme was synthesized by mRNA. The enzyme was synthesized by cDNA. The HERC2 fragments, cDNA fragments, PCR fragments, pcDNA3 fragments, PCR fragments, PCR fragments, pcDNA3 fragments, PCR fragments, and so on, could not be detected in this paper. After that, it is common to use molecular biology methods to improve the quality of the HERC2, the full-length and the various kinds of cDNA. The HERC2 organization shows that the results of the test, the amount of bone reinforcement in the heart is low, and the HERC2 organization shows that the results show that the results are good. The results of the experiments were compared with the results of the HERC2 test, and the results of the tests were obtained. The results showed that the cell operators were aware of the results of the tests, and the important mechanisms of the activities of the HERC2 workers were able to hold the records to show that they were instigated.