幹細胞制御に関わるマイクロRNAのプロスペクティブな分離・同定法の開発

改良型microRNAセンサーベクターには,EF1αプロモーターを改変し両方向性に働くプロモーターが構築され,その上流および下流にTurboGFP, EYFP(Yellow fluorescence protein)蛍光遺伝子が挿入されている。このGFPの下流にC/EBPalpha, Notch, GATA-1, GATA-2の3'UTRをクローニングし、造血幹細胞に強制発言した。この結果,転写因子Notch1の3'UTRを持つベクター導入細胞ではGFP蛋白の発現がほぼ完全に抑制されたが、他の転写因子の3'-UTRではまったく変化がなかった。以上から, Notch1は造血幹細胞レベルでmicroRNAもしくはRNAinhi bitory proteinによる3'UTRを介した翻訳制御をうけていることが示唆された。このNotch1の翻訳制御機構を明らかにするため、ベクター中のNotch1 3'UTRに変異を導入し、その責任部位を同定したところ、上流120bp内のATTTATTTAsequenceにその活性が存在しており、RNAbinding proteinによるNotch1の翻訳抑制が幹細胞分画で働いていることが明らかとなった。現在、このRNAbillding proteinを同定するために、Biotinでラベルしたresponsible sequenceを含むNotch1-3'UTRを用いたpull downを試みている。以上のように、この新規ベクターの開発は、造血幹細胞のT細胞へ分化が翻訳制御により抑えられていることを示唆する、極めて重要な発見に繋がった。

改良型microRNAセンサーベクターには,EF1αプロモーターを改変し両方向性に働くプロモーターが構築され,その上流および下流にTurboGFP, EYFP(Yellow fluorescence protein)蛍光遺伝子が挿入されている。このGFPの下流にC/EBPalpha, Notch, GATA-1, GATA-2の3'UTRをクローニングし、造血幹細胞に強制発言した。この結果,転写因子Notch1の3'UTRを持つベクター導入細胞ではGFP蛋白の発現がほぼ完全に抑制されたが、他の転写因子の3'-UTRではまったく変化がなかった。以上から, Notch1は造血幹細胞レベルでmicroRNAもしくはRNAinhi bitory proteinによる3'UTRを介した翻訳制御をうけていることが示唆された。このNotch1の翻訳制御機構を明らかにするため、ベクター中のNotch1 3'UTRに変異を導入し、その責任部位を同定したところ、上流120bp内のATTTATTTAsequenceにその活性が存在しており、RNAbinding proteinによるNotch1の翻訳抑制が幹細胞分画で働いていることが明らかとなった。現在、このRNAbillding proteinを同定するために、Biotinでラベルしたresponsible sequenceを含むNotch1-3'UTRを用いたpull downを試みている。以上のように、この新規ベクターの開発は、造血幹細胞のT細胞へ分化が翻訳制御により抑えられていることを示唆する、極めて重要な発見に繋がった。