部位特異的組換え系を用いた染色体工学技術の開発

点击翻译按钮获取中文摘要

これまでに、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)の染色体上に大きな欠失と逆位の導入、非相同染色体間の組換え及び一染色体細胞の造成に成功した。本年度は、以下の4項目についての進展があった。1)第XV染色体右腕セントロメア近傍にあるとされていたPHO80遺伝子と、同じ右腕上でそれか3120cM離れたHIS3の間で欠失の造成を試みたところ、予想に反して、PHO80座がセントロメア近傍右腕にあることが分かり、本操作で約360kbの環状染色体が得られることを確認した。2)同様にして非相同染色体間の組換えにより、新発見のTUB3ーPHO84ーGTR13遺伝子の相対的位置について、GTR1がセントロメア側と決定した。3)出芽酵母と分裂酵母Schizosaccharomyces pombe間で雑種染色体の造成を試みた。分裂酵母の染色体DNAをアガロ-ズビ-ズ法で調製し、制限酵素MluIで部分分解し、特異的組換え部位DNA断片(RS断片)を持つYAC(酵母人工染色体)ベンタ-に結合し、第XIII染色体左腕にあるPHO84遺伝子座にRS断片をもつ出芽酵母細胞に導入した。この細胞内で組換え酵素R生産プラスミドを発現させると、組換えYACベクタ-と第XIII染色体間で組換えが起こり、約100kbの分裂酵母染色体DNAを結合した染色体が得られた。4)植物への応用を目指して、βーglucuronidase遺伝子(GUS)を挾むようにRS断片を互いに逆向きに2ヶ結合たプラスミドと、カリフラワ-モザイクウイルス35Sプロモ-タ-を結合したR組換え酵素遺伝子をタバコ培養細胞へ導入した。また、GUS遺伝子とブロモ-タ-間に、2.3kbのDNA断片の両側にRSを同方向に結合して挿入した構造体をタバコ培養細胞の染色体に挿入した。いずれの場合も、R酵素により高頻度で組換えが起こることがGUS遺伝子の発現で検出され、プラスミドあるいは染色体の改変が行われることを確かめた。