糖脂質の糖鎖解析に有用な微生物酵素の生産とその応用

用于糖脂聚糖分析的微生物酶的生产及其应用

• 批准号: 05660090
• 负责人: 山本 憲二
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05660090/
• 关键词: エンドグリコセラミダーゼ; Corynebacterium sp.; スフィンゴ糖脂質; 2次元糖鎖マップ; ガングリオシド; コレラ毒素; HeLa細胞

我々が土壌中より単離同定したCorynebacterium属の一菌株はスフィンゴ糖脂質の糖鎖を脂質(セラミド)との結合部で特異的に切断し遊離する酵素であるエンドグリコセラミダーゼを主として細胞膜結合酵素として生産する。本研究では本酵素を用いることによって糖脂質の糖鎖分析法を開発するとともに、細胞膜上の糖脂質糖鎖の機能解析に応用した。1.酵素の精製とN-末端アミノ酸の解析:グルコース培地で培養した本菌を界面活性剤の存在下で超音波処理することにより可溶化した酵素標品について、イオン交換カラムクロマトグラフィーや疎水性ゲルクロマトグラフィーなどにより単一タンパクに精製した。精製過程における酵素反応には微量遠心機を活用した。精製酵素についてN-末端ペプチドの分析を試みたところ、N-末端アミノ酸がブロックされていることがわかった。2.HPLCによる糖脂質糖鎖の2次元マップの作成:種々の糖脂質に本酵素を作用させて、遊離した糖鎖を2-アミノピリジンで蛍光標識した後、順相および逆相カラムを用いたHPLCを行うことによって2次元糖鎖マップを作成した。その結果、このマップに基づいて分析することにより、類似した構造を持つ酸性糖脂質ガングリオシドの糖鎖や中性糖脂質の糖鎖をそれぞれ区別することができた。3.細胞膜上の糖脂質糖鎖の機能解析:コレラ毒素は細胞膜上の酸性糖脂質ガングリオシドGM1を受容体として細胞内に感染する。そこでHeLa細胞をブチル酸ナトリウムで処理して細胞膜上のGM1を多量に発現させた後、本酵素を作用し、次いでコレラ毒素を感染させたところ、酵素末処理の細胞に比べて細胞内のcAMPの蓄積が著しく減少した。この結果は細胞膜上の糖脂質が毒素の受容体になっていることが確認された。

We identified Corynebacterium as a strain of the genus Glycolipid (glycolipid) in the soil. The enzyme was isolated from the cell membrane synthase and the cell membrane synthase was isolated. In this study, the enzyme was analyzed by glycolipid glucose assay and cell membrane glycolipid glucose analyzer. 1. The enzyme was purified from the N-terminal of the enzyme. The results showed that the interfacial activity of the bacteria was detected in the presence of ultrasound and solubilization. the enzyme labelled enzyme was soluble, and the enzyme labelled product was soluble. During the process, enzyme reverse reaction is used to detect the active use of the heart machine. Seminal enzyme, N-terminal, N-terminal and N-terminal. 2.HPLC Glycolipids, glycolipid, glycolipid, glycolipid The results, the results, the results and the results. 3. Glycolipid on the cell membrane can be analyzed by the machine: the acid glycolipid on the cell membrane of the toxin, the acid glycolipid, the GM1 receptor, the intracellular infection. The amount of GM1 on the cell membrane was higher than that of HeLa, and the effect of this enzyme on the cell membrane was higher than that of intracellular cAMP. The results showed that the receptor of glycolipid toxin on the cell membrane was confirmed.

项目成果

H.Ashida et al.: "Transglycosylation Activity of Endoglycoceramidase from Corynebacterium sp." Arch.Biochem.Biophys.305. 559-562 (1993)

H.Ashida 等人：“棒状杆菌属的神经酰胺内切酶的转糖基化活性”。

山本 憲二: "糖タンパク質糖鎖を切断する微生物のエンドグリコシダーゼとその応用" 日本農芸化学会誌. 67. 1729-1733 (1993)

Kenji Yamamoto：“切割糖蛋白糖链的微生物内切糖苷酶及其应用”日本农业化学学会杂志 67. 1729-1733 (1993)。

K.Yamamoto et al.: "Novel Specificities of Mucor hiemalis Endo-β-N-acetylglucosaminidase Acting Complex Asparagine-Linked Oligosaccharides" Biosci.Biotech.Biochem.58. 72-77 (1994)

K. Yamamoto 等人：“冬毛霉内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶作用复合物天冬酰胺连接寡糖的新特性”Biosci.Biotech.Biochem.58 (1994)。