微生物のエンドグリコシダーゼを用いた糖鎖の機能解析と酵素の遺伝子に関する研究

我々が土壌中より単離同定したMucor hiemalisが培養液中に生産するEndo-β-N-acetylglucosaminidase(Endo-M)は糖タンパク質のアスパラギン結合糖鎖の高マンノース型、混成型糖鎖のみならず複合型糖鎖をも切断遊離することのできる特異的なエンドグリコシダーゼである。本研究では本酵素の糖転移活性を利用することによって糖鎖をタンパク質やペプチドに付加することを試みるとともに、本酵素の有用性に鑑みて遺伝子の解析を試みた。1.糖鎖の転移活性:本酵素は糖タンパク質のアスパラギン結合糖鎖のジアセチルキトビオース結合に作用して糖鎖を切断遊離する加水分解活性を有している一方、糖鎖を受容体に転移する糖転移活性をも有することを見出した。即ち、糖鎖の受容体としてN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)を用い複合型糖鎖を有するヒト血清アシアロトランスフェリンの糖ペプチドを供与体として、本酵素による糖鎖の転移を調べたところ、GlcNAcに糖鎖が付加した糖(鎖)転移生成物を確認した。2.糖鎖の転移受容体:糖鎖の転移受容体について調べたところ、GlcNAcのみならず、ジアセチルキトビオースやトリアセチルキトトリオースなどにもアシアロトランスフェリンの複合型糖鎖が転移することをHPLC分析などによって確認した。3.糖(鎖)転移活性測定法の開発:本酵素の糖鎖転移活性を、ピリジルアミノ化したジアセチルキトビオースを受容体として用いることにより、HPLCで迅速に分析することができる方法を開発した。4.卵白アルブミンの糖鎖のすげ替え:高マンノース型糖鎖を持つ卵白アルブミンをプロナーゼで消化して得られた糖ペプチドにEndo-HタイプのEndo-β-N-acetylglucosaminidaseを作用した後、アシアロトランスフェリン糖ペプチドを糖鎖供与体として、Endo-Mを作用したところ、複合型糖鎖を持つ卵白アルブミンの糖ペプチドが得られることを確認した。5.Endo-Mのクローニングのためにペプチド断方のアミノ酸配分を分析した。

我々が土壌中より単離同定したMucor hiemalisが培養液中に生産するEndo-β-N-acetylglucosaminidase(Endo-M)は糖タンパク質のアスパラギン結合糖鎖の高マンノース型、混成型糖鎖のみならず複合型糖鎖をも切断遊離することのできる特異的なエンドグリコシダーゼである。本研究では本酵素の糖転移活性を利用することによって糖鎖をタンパク質やペプチドに付加することを試みるとともに、本酵素の有用性に鑑みて遺伝子の解析を試みた。1.糖鎖の転移活性:本酵素は糖タンパク質のアスパラギン結合糖鎖のジアセチルキトビオース結合に作用して糖鎖を切断遊離する加水分解活性を有している一方、糖鎖を受容体に転移する糖転移活性をも有することを見出した。即ち、糖鎖の受容体としてN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)を用い複合型糖鎖を有するヒト血清アシアロトランスフェリンの糖ペプチドを供与体として、本酵素による糖鎖の転移を調べたところ、GlcNAcに糖鎖が付加した糖(鎖)転移生成物を確認した。2.糖鎖の転移受容体:糖鎖の転移受容体について調べたところ、GlcNAcのみならず、ジアセチルキトビオースやトリアセチルキトトリオースなどにもアシアロトランスフェリンの複合型糖鎖が転移することをHPLC分析などによって確認した。3.糖(鎖)転移活性測定法の開発:本酵素の糖鎖転移活性を、ピリジルアミノ化したジアセチルキトビオースを受容体として用いることにより、HPLCで迅速に分析することができる方法を開発した。4.卵白アルブミンの糖鎖のすげ替え:高マンノース型糖鎖を持つ卵白アルブミンをプロナーゼで消化して得られた糖ペプチドにEndo-HタイプのEndo-β-N-acetylglucosaminidaseを作用した後、アシアロトランスフェリン糖ペプチドを糖鎖供与体として、Endo-Mを作用したところ、複合型糖鎖を持つ卵白アルブミンの糖ペプチドが得られることを確認した。5.Endo-Mのクローニングのためにペプチド断方のアミノ酸配分を分析した。