微生物のエンドグリコシダーゼを用いた糖鎖の機能解析と酵素の遺伝子に関する研究

利用微生物糖苷内切酶进行糖链功能分析及酶基因研究

• 批准号: 05274215
• 负责人: 山本 憲二
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05274215/
• 关键词: Endo-β-N-acetylglucosaminidase; Mucor hiemalis; 糖タンパク質; アスパラギン結合糖鎖; 複合型糖鎖; 糖転移反応; アシアロトランスフェリン

我々が土壌中より単離同定したMucor hiemalisが培養液中に生産するEndo-β-N-acetylglucosaminidase(Endo-M)は糖タンパク質のアスパラギン結合糖鎖の高マンノース型、混成型糖鎖のみならず複合型糖鎖をも切断遊離することのできる特異的なエンドグリコシダーゼである。本研究では本酵素の糖転移活性を利用することによって糖鎖をタンパク質やペプチドに付加することを試みるとともに、本酵素の有用性に鑑みて遺伝子の解析を試みた。1.糖鎖の転移活性:本酵素は糖タンパク質のアスパラギン結合糖鎖のジアセチルキトビオース結合に作用して糖鎖を切断遊離する加水分解活性を有している一方、糖鎖を受容体に転移する糖転移活性をも有することを見出した。即ち、糖鎖の受容体としてN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)を用い複合型糖鎖を有するヒト血清アシアロトランスフェリンの糖ペプチドを供与体として、本酵素による糖鎖の転移を調べたところ、GlcNAcに糖鎖が付加した糖(鎖)転移生成物を確認した。2.糖鎖の転移受容体:糖鎖の転移受容体について調べたところ、GlcNAcのみならず、ジアセチルキトビオースやトリアセチルキトトリオースなどにもアシアロトランスフェリンの複合型糖鎖が転移することをHPLC分析などによって確認した。3.糖(鎖)転移活性測定法の開発:本酵素の糖鎖転移活性を、ピリジルアミノ化したジアセチルキトビオースを受容体として用いることにより、HPLCで迅速に分析することができる方法を開発した。4.卵白アルブミンの糖鎖のすげ替え:高マンノース型糖鎖を持つ卵白アルブミンをプロナーゼで消化して得られた糖ペプチドにEndo-HタイプのEndo-β-N-acetylglucosaminidaseを作用した後、アシアロトランスフェリン糖ペプチドを糖鎖供与体として、Endo-Mを作用したところ、複合型糖鎖を持つ卵白アルブミンの糖ペプチドが得られることを確認した。5.Endo-Mのクローニングのためにペプチド断方のアミノ酸配分を分析した。

Endo-β-N-acetylglucosaminidase(Endo-M), produced in a single and uniform solution in our native soil by Mucor hiemalis in culture medium, has a unique and unique ability to cut off the free chain by combining the high-quality sugar chain of the sugar chain with the high-quality sugar chain and the complex sugar chain of the mixed sugar chain. In this study, we tried to use the enzyme's sugar transfer activity to determine the enzyme's usefulness and to analyze the protein. 1. Carbohydrate transfer activity: This enzyme has the ability to bind to the carbohydrate, to dissociate the carbohydrate, and to transfer the carbohydrate to the receptor. That is to say, the sugar lock receptor and the N-type sugar lock receptor (GlcNAc) have been used to identify the sugar lock shift product of the enzyme. 2. Carbohydrate shift receptor: Carbohydrate shift receptor in the middle of the adjustment, GlcNAc concentration, separation, separation, 3. Development of a method for determining carbohydrate shift activity: A rapid assay for carbohydrate shift activity of the enzyme was developed by HPLC. 4. To confirm the effect of Endo-β-N-acetylglucosaminase on the endo-H-glucosaminase of the endo-H-glucosaminase, the endo-M-glucosaminase of the endo-H-glucosaminase 5.Endo-M acid partition analysis

项目成果

H.Ashida et al.: "Transglycosylation Activity of Endoglycoceramidase from Corynebacterium sp." Arch.Biochem.Biophys.305. 559-562 (1993)

H.Ashida 等人：“棒状杆菌属的神经酰胺内切酶的转糖基化活性”。

山本 憲二: "糖タンパク質糖鎖を切断する微生物のエンドグリコシダーゼとその応用" 日本農芸化学会誌. 67. 1729-1733 (1993)

Kenji Yamamoto：“切割糖蛋白糖链的微生物内切糖苷酶及其应用”日本农业化学学会杂志 67. 1729-1733 (1993)。

K.Yamamoto et al.: "Novel Specificities of Mucor hiemalis Endo-β-N-acetylglucosaminidase Acting Complex Asparagine-Linked Oligosaccharides" Biosci.Biotech.Biochem.58. 72-77 (1994)

K. Yamamoto 等人：“冬毛霉内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶作用复合物天冬酰胺连接寡糖的新特性”Biosci.Biotech.Biochem.58 (1994)。