デスモヨ-キンの角化細胞間接着における機能の解析と皮膚疾患への関与の検討

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今年度はデスモヨ-キンの細胞膜および核内への移行に関する分子内部位の機能を明らかにする目的で、特徴的な配列を示すデスモヨ-キンのN末端・中心部のcDNAを有核細胞発現系ベクターに組み込んだ。すなわち、ヒトAHNAK遺伝子クローンをテンプレートとしてそれぞれの部位のcDNAをPCR法にて増幅しpcDNAl/Ampに組み込んだ。その際、その部分蛋白分子の細胞内での分布を蛍光抗体的に検索するためにそれぞれのインサートの3'末端に7回tandemに繰り返すc-myc配列を組み込みんだ。そして、そのコンストラクトをトランジエント・トランスフェクションの系を用いて各種有核細胞に発現させた。まず、そのクローンの特異性を確認する目的で、トランスフェクション効率の高いCOS7細胞を用い、その特異性をc-myc配列に対するモノクローナル抗体を用いた蛍光抗体間接法により確認した。さらに、免疫ブロット法を用いて、正しい大きさの蛋白が発現していることを確認した。その後、種々の培養角化細胞として、ヒト扁平上皮癌由来のKU8およびDJM1細胞、また、MDCK細胞にトランスフェクトし、それぞれの蛋白の細胞内での分布を蛍光抗体法により検出した。その結果、何れの細胞においても、N末端・中央部の部分蛋白とも、細胞質内、核内に分布し、細胞膜内への移行は見られなかった。この分布は共焦点レーザー顕微鏡を用いた詳細な検討においても確認された。コントロールのデスモプラキンの染色パターンは中間径線維に結合して細繊維状に見られたのに対し、デスモヨ-キンの染色パターンはびまん性に見られたためデスモヨ-キンは中間径線維に結合していないと考えられた。これらの事実より、デスモヨ-キンのN末端・中央部の部分はこの蛋白の細胞膜への移行には関与していないことが示唆された。今後、残りの、C末端部についても同様に検討する必要がある。