アラビドプシス変異株を用いた左右性決定機構の解明

点击翻译按钮获取中文摘要

1.SPR2-GFPをCaMV35Sプロモーターを用いて植物体で強制発現させると、GFP蛍光は表層微小管に局在し、一部は微小管上に数珠状に連なったドットとして観測された。通常の野生型細胞ではSPR2の発現レベルは低いので、野生型レベルで発現させた場合の細胞内局在性を調べた。SPR2ゲノム領域に2分子のGFPをタンデムに挿入し、形質転換植物体を作製したところ、GFP蛍光が微小管上に数珠状に連なって観察された。2.微小管重合阻害剤プロピザミドに対する感受性が野生型と異なる変異株をスクリーニングすることにより、これまでに多数のチューブリン変異株を得た。これらの変異株は右または左巻きねじれを示す半優性変異であり、αまたはβチューブリンのアミノ酸置換変異であった。根伸長領域の表皮細胞において、細胞の伸長(ねじれ)方向と表層微小管束の配向の間の相関を調べたところ、左巻き方向にねじれる変異株はすべて右巻きの表層微小管束をもっており、反対に右巻き変異株はすべて左巻き微小管束を示した。すなわち、微小管束の直角方向に細胞が伸長した。3.新規の右巻き変異株spiral3を単離し、その原因遺伝子を同定したところ、γチューブリン環状複合体γTuRCの構成成分Grip84のアミノ酸置換変異であった。γTuRCは真核生物で保存された微小管重合核形成中心であり、植物の間期細胞では細胞膜内側に局在すると考えられている。酵母2ハイブリッド解析により、変異型Grip84ではGrip91との相互作用が弱くなっていた。spr3変異株ではγTuRCの安定性と重合核機能が損なわれたため、表層微小管の動態が変化したと想像される。4.GFPをβチューブリンのN末端に融合したGFP-TUBを強制発現させた植物体を用いて、in vivoにおける表層微小管の動態をスピンディスク型共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察する方法を確立した。