切断部位特異抗体と合成ペプチドを用いたポリペプチドC末端微量解析

使用切割位点特异性抗体和合成肽进行多肽 C 末端痕量分析

• 批准号: 14658190
• 负责人: 大海 忍
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14658190/
• 关键词: タンパク質; 末端分析; アミノ酸配列; 一次構造; 抗体; プロテアーゼ; カルボキシル末端; 質量分析

平成14年度は,カルパスタチン断片に対する切断部位特異抗体が認識する新たな95kDa分子が非骨格筋型ミオシン重鎖(A型)(MH-A)の断片であることを明らかにし,切断部位の決定を行った.C末端の解析は,MH-Aに存在するカスパーゼ認識配列をペプチド合成し,イムノブロットに対する競合で調べた.その結果,抗--DAID-COOH抗体がC末端配列--EEVD-COOHに結合したことが判明した.同様な方法でアポトーシス細胞抽出液からカスパーゼによって生成するC末端を検索すると,熱ショックタンパク質関連分子Apg-2とDNA依存性プロテインキナーゼ構成要素Ku80が新たに見つかった.これらの分子はいずれも今までに報告されておらず,切断部位特異抗体の分子検索ツールとしての有用性が再確認された.特に,Ku80では本来のC末端から2残基がカスパーゼによって遊離するという電気泳動では検出できないプロテオリシスが発見された.Apq-2に対する切断部位特異抗体(免疫原:--DHLD-COOH)をもちいて,C末端配列の認識特異性について詳細な検討を行った.C末端4残基を種々のアミノ酸で置換し,AAAAAADHLX-COOH, AAAAAADHXD-COOH,AAAAAADXLD-COOH,AAAAAAXHLD-COOH(X;A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;AAAAAAはスペーサー)を固定化したELISAで抗体の結合を調べた.その結果,C末端1残基目はアミド型Dやグルタミン酸には結合せずDに特異的であること,2残基目はイソロイシンやバリンとは反応が弱くLに特異的であることがわかった.3残基目では,L>H>F>M>Y>W>C>N>I>Tの順に結合した.4残基目はどのようなアミノ酸でも同等に結合する傾向がみられた.本研究によってC末端3残基が抗原抗体反応にかかわっていることが明らかになり,新しいC末端解析法を実行するための基盤が確立した.

14 year は pp.47-53, カ ル パ ス タ チ ン fragment に す seaborne る cut off parts of specific antibody が know す る new た な 95 kda molecular が non skeletal muscle ミ オ シ ン heavy lock (type A) (MH - A) の fragment で あ る こ と を Ming ら か に し, cut off the part line の decided を っ た. C terminal の parsing は, MH - A に exist す る カ ス パ ー ゼ を meet with Synthesis し ペ プ チ ド, イ ム ノ ブ ロ ッ ト に す seaborne る co-opetition で adjustable べ た. そ の result, anti - DAID - COOH antibody が C terminal assortment - EEVD - COOH に combining し た こ と が.at し た. With others in な method で ア ポ ト ー シ ス cell extract か ら カ ス パ ー ゼ に よ っ て generated す る C terminal を 検 cable す る と, hot シ ョ ッ ク タ ン パ ク qualitative masato even molecules Apg - 2 と DNA dependency プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼ elements Ku80 が new た に see つ か っ た. こ れ ら の molecular は い ず れ も today ま で に report さ れ て お ら ず, cut The specific antibody of the site of the lesion, the <s:1> molecule 検, the <s:1> と と て て て, the usefulness が reconfirmation された. に, Ku80 で は の originally C terminal か ら 2 residues が カ ス パ ー ゼ に よ っ て free す る と い う electric 気 swimming で は 検 out で き な い プ ロ テ オ リ シ ス が 発 see さ れ た. Apq - 2 に す seaborne る cut off site specific antibodies (immunogen: - DHLD - -cooh) group を も ち い て, C terminal with column の know specific に つ い て in detail Youdaoplaceholder0 seek を rows った. The 4-residue at the c-terminal を kinds of 々 々 ア ノ ノ ノ acid で displacement を,AAAAAADHLX-COOH, AAAAAADHXD-COOH,AAAAAADXLD-COOH,AAAAAAXHLD-COOH(X; A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y; AAAAAA は ス ペ ー サ ー) を immobilized し た ELISA の で antibody combining を adjustable べ た. そ の as a result, the C terminal 1 residue は ア ミ ド type D や グ ル タ ミ ン acid に は combining せ ず D に specific で あ る こ と, 2 residue は イ ソ ロ イ シ ン や バ リ ン と は anti 応 が weak く L に specific で あ る こ と が わ か っ た. 3 residues で は, L > > > > M > > Y F W H C > N > I > T の shun に combining し た. 4 residue mesh は ど の よ う な ア ミ ノ acid で も equal に combining す る tendency が み ら れ た. This study に よ っ て C terminal 3 residues が antigen antibody against 応 に か か わ っ て い る こ と が Ming ら か に な り, new し い C terminal analytic method を line be す る た め の base plate が establish し た.

项目成果

Niikura Y: "Monitoring of Caspase-8/FLICE Processing and Activation upon Fas Stimulation with Novel Antibodies Directed against a Cleavage Site for Caspase-8 and Its"J Biochem. 132. 53-62 (2002)

Niikura Y：“用针对 Caspase-8 及其裂解位点的新型抗体监测 Fas 刺激后的 Caspase-8/FLICE 加工和激活”J Biochem。

Yamamoto K: "Cloning of Hamster Type XVII Collagen cDNA, and Pathogenesis of Anti-Type XVII Collagen Antibody and Complement in Hamster Bullous Pemphigoid"J Invest Dermatol. 118. 485-492 (2002)

Yamamoto K：“仓鼠 XVII 型胶原 cDNA 的克隆以及仓鼠大疱性类天疱疮中抗 XVII 型胶原抗体和补体的发病机制”J Invest Dermatol。

Yamashima, T.: "Sustained calpain activation associated with lysosomal rupture executes necrosis of the postischemic CA1 neurons in primates"Hippocampus. 13(7). 791-800 (2003)

Yamashima, T.：“与溶酶体破裂相关的持续钙蛋白酶激活导致灵长类动物海马缺血后 CA1 神经元坏死。”

Sakiyama H: "Characterization of mineral deposits formed in cultures of a hamster tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and alkaline phosphatase (ALP)"Cell Tissue Res. 309. 269-279 (2002)

Sakiyama H：“仓鼠酒石酸抗性酸性磷酸酶 (TRAP) 和碱性磷酸酶 (ALP) 培养物中形成的矿物质沉积的表征”细胞组织研究。

Tanaka Y: "Reveromycin A inhibits antigen receptor-mediated antigen presentation by B lymphoma cells via its effect on intracellular trafficking of the antigen"J Antibiot. 55. 904-913 (2002)

Tanaka Y：“Reveromycin A 通过其对抗原细胞内运输的影响，抑制 B 淋巴瘤细胞抗原受体介导的抗原呈递”J Antibiot。