合成ペプチドと特殊抗体を活用した新規プロテアーゼ解析法

使用合成肽和特殊抗体的新型蛋白酶分析方法

• 批准号: 11144207
• 负责人: 大海 忍
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11144207/
• 关键词: カルパイン; カルパスタチン; カスパーゼ; アポトーシス; 切断部位; 抗体; 標的分子検索; プロテアーゼ

ヒトT細胞JurkatのFas抗原を刺激するとアポトーシスが誘導されるが,このときカルパインの内在性阻害タンパク質カルパスタチンが断片化することを発見した.カルパスタチンの断片化は,カスパーゼの阻害剤でアポトーシスを抑えると同時に抑制された.ヒトカルパスタチン全長をコードするcDNAを大腸菌で発現させたリコンビナントタンパク質を用いて,アポトーシス細胞由来の細胞質画分がカルパスタチンを切断するか調べたところ,細胞レベルと同様な限定分解が認められた.カルパスタチンの限定分解は,非アポトーシス細胞の細胞質画分では起こらず,一連のカスパーゼ阻害剤で抑えられた.リコンビナントカルパスタチンにカスパーゼ3あるいは7を作用させると,限定分解が起こり,切断部位は233残基目のアスパラギン酸のカルボキシル末端側であることが判明した.その結果,カルパスタチンの4個のカルパイン阻害ユニットの内のアミノ末端側が限定分解によって破壊されることが分かった.限定分解によって生じるアミノ末端側の断片に対する切断部位特異抗体を作成し,アポトーシス時のカルパスタチンの細胞内動態を調べると,アミノ末端側断片は速やかに代謝されていることが示唆された.ところがこの抗体は,カルパスタチンとは異なる新たな分子を認識した.部分アミノ酸配列決定により,ひとつは熱ショックタンパク質に属するAPG-2であることが分かった.本研究では,切断部位特異抗体を用いて類似した特異性をもつカスパーゼの標的分子の検索が可能であることが示された.現在,方法論の一般化を試みている.

ヒトT cell JurkatのFas antigenをstimulationするとアポトーシスがinducingされるが,このときカルパインのintrinsic obstacle to the quality of カルパスタチンが fragmentation することを発见した.カルパスタチンの fragmentation は, カスパーゼの hindering 剤 でアポトーシスを suppresses えるとsimultaneously suppressing された. ヒトカルパスタチンFull-length をコードするcDNAをEliform coliform させたリコンビナントタンパクqualityをいて, アポトーシスcell originのcytoplasm drawing がカルパスタチンをcut するか调べたところ, fine Cellular cells are limited to decompose cellsのcytoplasm painting points では rises こらず, 一连カスパーゼ hinders 剤で suppresses えられた.リコンビナントカルパスタチンにカスパーゼ3あるいは7を Effect させると, limited decomposition がrise こり, cutting site は 233 residues目のアスパラギン acid のカルボキシル terminal side であることが clarified した.その results, カルパスタチンの4 pieces of のカルパイン blocker ユニットの内のアミノ terminal side がlimited decomposition によってbreak 壊されることがIt is divided into 10 pieces. It is made with limited decomposition of the end-side fragment of the cleavage site-specific antibody,アポトーシス时のカルパスタチンの Intracellular dynamic を Adjustment べると, アミノ terminal side fragment はspeed やかに metabolismされていることが出された.ところがこのantibodyは,カルパスタチンとはISOなる新たなmoleculeをKnowledge of した. Part of the アミノ acid combination determines により, ひとつは热ショックタンパク性に genus するAPG- 2. It is divided into two parts. In this study, the cutting site-specific antibody is similar to the specific one. The molecular の検SOがpossibility of the パーゼのtarget is the であることがshow された. Now, the methodology の generalization をtest みている.

项目成果

Fujikawa, H.: "Activation of protein kinases in canine basilar artery n vasospasm"J. Cerebral Blood Flow Metabol.. 19. 44-52 (1999)

Fujikawa, H.：“犬基底动脉血管痉挛中蛋白激酶的激活”J。

Shiroki, K.: "Intracellular redistribution of truncated La protein produced by polyovirus 3Cro-mediated cleavage"J. Virol.. 73. 2193-2200 (1999)

Shiroki, K.：“多病毒 3Cro 介导的切割产生的截短 La 蛋白的细胞内重新分布”J.

Nonaka, T.: "Shigella flexineri YSH6000 induces two type of cell death, apoptosis and oncosis, in the differentiated human monoblastic cell U937"Microbiol. Lett.. 174. 89-95 (1999)

Nonaka, T.：“福氏志贺氏菌 YSH6000 在分化的人单核细胞 U937 中诱导两种类型的细胞死亡：细胞凋亡和肿瘤细胞死亡”Microbiol。

Kato, M.: "Caspases cleave the amino-terminal calpain inhibitory unit of calpastatin during apoptosis in human Jurkat T cells"J. Biochem.. 127. 297-305 (2000)

Kato, M.：“在人 Jurkat T 细胞凋亡过程中，半胱天冬酶会裂解钙蛋白酶抑制剂的氨基末端钙蛋白酶抑制单位”J.

Kawakami, T.: "TTG as the initiation codon of Salmonella sly A, a gene required for survival within macrophages"Microbiol. Immunol. 43. 351-357 (1999)

Kawakami, T.：“TTG 作为沙门氏菌 sly A 的起始密码子，是巨噬细胞内生存所需的基因”微生物学。