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共有結合型阻害剤に特異的な抗体を用いたプロテアーゼの活性化機構と生理機能の解析

使用共价抑制剂特异性抗体分析蛋白酶激活机制和生理功能

基本信息

批准号：
09267205
负责人：
大海忍
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

プロテアーゼの動態を細胞レベルで解析する方法としてプロテアーゼ阻害剤に対する抗体に着目した。細胞を阻害剤で処理して細胞レベルでの現象変化と対応させながらプロテアーゼの生理機能を推定することが多いため、本抗体は阻害剤の標的分子の同定や細胞内局在の決定に寄与すると考えたからである。阻害剤としては、酵素・阻害剤複合体の安定性を考慮して標的酵素に不可逆的に作用するエポキシコハク酸誘導体E64c(標的はシステインプロテアーゼ)とZ-VADフルオロメチルケトン(標的はカスパーゼ)を選んだ。システインプロテアーゼ(カルパイン)の活性中心のシステイン残基周辺領域をMultiple peptide synthesis法で化学合成し、システインのSH基にE64cを導入した。これをウサギに投与して抗体を得た。この抗体は、E64c処理したカルパイン大鎖をイムノブロットで染めたが、他のシステインプロテアーゼに取り込まれたE64cとも反応した。すなわち本抗体は、標的酵素の活性中心のペプチド部分よりもE64cを強く認識するため、システインプロテアーゼに広く使用できると考えられる。細胞に脂溶性の誘導体E64dをかけると膜を透過してE64cに変換されて細胞内酵素に作用し、細胞増殖が停止する。このとき複数のタンパク質がE64cで標識されることが判明した。Z-VADフルオロメチルケトンに対する抗体は、Z-Val-OHを用いてZ-Val-Ala-Asp-Cys-OHを合成しCysのSH基を介してキャリアタンパク質に結合させて免疫した。本抗体は、イムノブロットには適さなかったが、免疫沈降法で阻害剤で不活化したカスパーゼを結合した。現在、これらの抗体を既に確立した切断部位特異抗体と併せて、細胞レベルでのプロテアーゼ機能解析に活用している。

The method of analysis of the cell dynamics of the virus is described in detail below. This antibody is used to determine the identity of the target molecule of the inhibitor and to determine whether the inhibitor is present in the cell. The stability of the inhibitor complex is considered. The target enzyme is selected from the group consisting of irreversible enzyme action, acid inducer E64c (target enzyme) and Z-VAD inhibitor. Chemical synthesis of E64c in the active center of E64c by Multiple peptide synthesis It's not like you're going to get any help. This antibody is E64c. The active center of the target enzyme of this antibody is identified by E64c. The lipid soluble inducer E64d was removed from the cell membrane and replaced by an intracellular enzyme, causing cell proliferation to cease. E64c is the symbol of the plural number of characters. Z-Val-OH is used to synthesize Z-Val-Ala-Asp-Cys-OH and Cys SH group is used to mediate anti-Cys antibody binding. The antibody is not activated by immunoprecipitation. Now, this antibody has been established, and the function analysis of the cut site specific antibody has been carried out.