食細胞の貧食殺菌機構における細胞内プロテア-ゼの役割の解析

申請者が今回開発した切断部位特異的抗体(活性型カルパインあるいはカルパインによって限定分解を受けたプロテインキナ-ゼCに特異的な抗体;プロテオリシスを受けた蛋白質には結合するが、未切断の蛋白質には反応しない)を、食細胞の活性化時におけるカルパインとその基質蛋白質であるプロテインキナ-ゼCの細胞内動態を解析するために応用し、本抗体を免疫細胞化学的に使用するための種々の実験条件を決定した。本研究の結果を、生化学的分析の結果と併せて、カルパインの食細胞機能における役割解明のための基礎とした。活性型カルパインあるいはカルパインによって切断されたプロテインキナ-ゼCをテフロン系疎水性膜に固定化し、細胞の固定に用いる種々の薬剤で処理、洗浄後、切断部位特異的抗体との反応性を調べた。グルタルアルデヒドをはじめとするほとんどの固定剤が抗体の結合に影響を与えなかったが、反応中のDFP、PMSF、TPCK、TLCK、Eー64、ロイペプチン等のプロテア-ゼ阻害剤があると抗原の分解が抑えられ、抗体の結合量が減少しなかった。ただし、白血球のセリンプロテア-ゼの阻害剤である3,4ージクロロイソクマリンは、2次抗体をペルオキシダ-ゼで標識した場合は使用できないことが判明した。次に、実際にカルシウムイオノフォア処理してカルパインの活性化とプロテインキナ-ゼCの限定分野を誘導した細胞をプロテア-ゼ阻害剤存在下種々の固定剤で処理し、酵素染色した。イオノフォア処理した細胞は非処理の細胞と比べて切断部位特異的抗体で明らかに陽性を示し、この方法が使用できることが明らかとなった。現在、種々の刺激剤で活性化した食細胞をこの抗体で染色するとともに、免疫電子顕微鏡で抗原の細胞内局在を解析している。

申請者が今回開発した切断部位特異的抗体(活性型カルパインあるいはカルパインによって限定分解を受けたプロテインキナ-ゼCに特異的な抗体;プロテオリシスを受けた蛋白質には結合するが、未切断の蛋白質には反応しない)を、食細胞の活性化時におけるカルパインとその基質蛋白質であるプロテインキナ-ゼCの細胞内動態を解析するために応用し、本抗体を免疫細胞化学的に使用するための種々の実験条件を決定した。本研究の結果を、生化学的分析の結果と併せて、カルパインの食細胞機能における役割解明のための基礎とした。活性型カルパインあるいはカルパインによって切断されたプロテインキナ-ゼCをテフロン系疎水性膜に固定化し、細胞の固定に用いる種々の薬剤で処理、洗浄後、切断部位特異的抗体との反応性を調べた。グルタルアルデヒドをはじめとするほとんどの固定剤が抗体の結合に影響を与えなかったが、反応中のDFP、PMSF、TPCK、TLCK、Eー64、ロイペプチン等のプロテア-ゼ阻害剤があると抗原の分解が抑えられ、抗体の結合量が減少しなかった。ただし、白血球のセリンプロテア-ゼの阻害剤である3,4ージクロロイソクマリンは、2次抗体をペルオキシダ-ゼで標識した場合は使用できないことが判明した。次に、実際にカルシウムイオノフォア処理してカルパインの活性化とプロテインキナ-ゼCの限定分野を誘導した細胞をプロテア-ゼ阻害剤存在下種々の固定剤で処理し、酵素染色した。イオノフォア処理した細胞は非処理の細胞と比べて切断部位特異的抗体で明らかに陽性を示し、この方法が使用できることが明らかとなった。現在、種々の刺激剤で活性化した食細胞をこの抗体で染色するとともに、免疫電子顕微鏡で抗原の細胞内局在を解析している。