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切断部位特異抗体を利用したアポトーシスプロテアーゼの標的分子の探索

使用切割位点特异性抗体搜索凋亡蛋白酶的靶分子

基本信息

批准号：
09878125
负责人：
大海忍
金额：
--
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

研究代表者が既に確立した切断部位特異抗体(プロテアーゼによって限定分解を受けたポリペプチド鎖末端領域に対する抗体)の手法を利用して、アポトーシスの情報伝達にかかわるプロテアーゼ(カスパーゼ)の未知の標的分子を同定する方法の開発を試みた。現在、カスパーゼは10種類以上に関連遺伝子が発見され、アポトーシスの実行過程において連鎖的に活性化すると考えられている。アポトーシス誘導時には様々なタンパク質がカスパーゼで限定分解を受けると、その生理的意義は明らかではない。いずれのカスパーゼも標的タンパク質のアスパラギン酸残基のカルボキシル末端側でペプチド結合を開裂する。そこでハプテンとして、10残基のププチドCys-X_8-Asp(CX_8D)を化学合成し、ウサギで切断部位特異抗体を作成した。ここでXはCys以外の19種類のアミノ酸の混合物であり、配列をランダム化してできるだけ多くの種類の抗原(アスパラギン酸残基のカルボキシル末端をもつポリペプチド)に結合するような抗体の集団がでるることを期待した。予備実験として既に切断部位特異抗体を得ているカルパインやプロテインキナーゼCについて、固定化した抗体で細胞粗抽出液から抗原を捕捉する方法を検討した。この結果に基づいてCX_8Dに対する抗体に結合するタンパク質をアポトーシスを起こした細胞でアフィニティーカラムを用いて検索すると、分子量3万のピリペプチドが見つかった。これはポリ(ADPリボース)ポリメラーゼに対する抗体と交叉したので、本酵素がカスパーゼ3で切断された断片と考えられる。未知の基質タンパク質を同定すべく、さらに微量の抗原を検索している。

The researchers have been trying to develop a method for identifying unknown target molecules by establishing a specific antibody for the site of cleavage (antibody for the terminal domain of cleavage) using information from the site of cleavage. At present, there are more than 10 kinds of related genes in the process of development, development and activation. The physiological significance of the change is clear. The amino acid residues in the amino acid residues of the amino acid residues of the amino acid residues Cys-X_8-Asp(CX_8D) was chemically synthesized and specific antibodies were prepared. This is expected to be the case with a mixture of 19 different kinds of amino acids other than Cys, which bind to a wide variety of antigens (including amino acid residues). To prepare a method for the capture of antigen in a cell extract by immobilizing antibodies and isolating site-specific antibodies The results showed that CX_8D could bind to the antibody, and the molecular weight of CX_8D was 30 thousand. This enzyme is called "ADP." unknown matrix, constant mass, and trace antigen detection