特殊抗体と合成ペプチドを用いたプロテインキナーゼCの細胞内動態の解析

使用特殊抗体和合成肽分析蛋白激酶 C 的细胞内动态

• 批准号: 07273215
• 负责人: 大海 忍
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07273215/
• 关键词: プロテインキナーゼ; タンパク質リン酸化; タンパク質分解; プロテアーゼ; 抗体; 合成ペプチド; アポトーシス; 細胞死

プロテインキナーゼC(PKC)のダウンレギュレーションの引き金と考えられている、カルパインによるPKCの限定分解を特異的に検出するための特殊抗体(切断部位特異抗体)を開発した。PKCにカルパインをin vitroで作用させて調製した断片の末端アミノ酸配列に基づいて、ハプテンとして使用するペプチドを合成した。これをウサギに免疫して得た抗体は、45-kDaのPKC断片に特異的に結合し、カルパインによる切断を受けていない80-kDaポリペプチドとは反応しなかった。カルシウムイオノフォア処理をして細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させた血球系培養細胞において、同様にして作成した活性型カルパインに対する切断部位特異抗体によってカルパイン前駆体の活性化とともにPKCの限定分解を検出した。これらの抗体を、血清除去によって細胞死(アポトーシス)を誘導したヒト繊維芽細胞TIG-3に適用すると、活性型カルパインおよびPKCαの断片がアポトーシス細胞に観察された。カルパイン阻害剤によってアポトーシスの亢進がおこることと併せて考えると、カルパインは細胞死を負の方向に制御し、PKCαがカルパインによるタンパク質分解の標的分子のひとつとしてアポトーシス抑制に関与している可能性が示唆される。

プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼ C (PKC) の ダ ウ ン レ ギ ュ レ ー シ ョ ン の lead き gold と exam え ら れ て い る, カ ル パ イ ン に よ る PKC の finite decomposition を specific に 検 out す る た め の specific antibody (cut off site specific antibodies) を open 発 し た. PKC に カ ル パ イ ン を in vitro で role さ せ て modulation し た fragment の end ア ミ ノ acid with column に base づ い て, ハ プ テ ン と し て use す る ペ プ チ ド を synthetic し た. こ れ を ウ サ ギ に immune し て は た antibody, 45 - kDa の PKC に specific fragment に し, カ ル パ イ ン に よ る cut を by け て い な い 80 - kDa ポ リ ペ プ チ ド と は anti 応 し な か っ た. カ ル シ ウ ム イ オ ノ フ ォ ア 処 Richard を し て in cells の カ ル シ ウ ム イ オ ン concentration rising を さ せ た blood cell is cultured cells に お い て, with others in に し て made し た activity type カ ル パ イ ン に す seaborne る cut off parts of specific antibody に よ っ て カ ル パ イ ン 駆 body before の activeness と と も に PKC の finite decomposition を 検 out し た. こ れ ら の を, serum antibodies to remove に よ っ て cell death (ア ポ ト ー シ ス) induced し を た ヒ ト 繊 TIG - 3 d bud cells に applicable す る と type, active カ ル パ イ ン お よ び PKC alpha の fragment が ア ポ ト ー シ ス cells に 観 examine さ れ た. カ ル パ イ ン resistance against tonic に よ っ て ア ポ ト ー シ ス の hyperthyroidism が お こ る こ と と and せ て exam え る と, カ ル パ イ ン は cell death を negative の direction に royal し, PKC alpha が カ ル パ イ ン に よ る タ ン パ ク の target molecular mass decomposition の ひ と つ と し て ア ポ ト ー シ ス inhibit に masato and し て い が る possibility in stopping さ れ る.

项目成果

Ogawara,M.: "Differential targeting of protein kinase C and CaM kinase II signalings to vimentin." J.Cell.Biol.131. 1055-1066 (1995)

Okawara,M.：“蛋白激酶 C 和 CaM 激酶 II 信号传导至波形蛋白的差异靶向。”

Kikuchi,H.: "Antibodies specific for proteolyzed forms of protein kinase Cα." Biochim.Biophys.Acta. 1269. 253-259 (1995)

Kikuchi, H.：“蛋白激酶 Cα 蛋白水解形式的特异性抗体。Biochim.Biophys.Acta。”1269. 253-259 (1995)

Takai,Y.: "Mitosis-specific phosphorylation of vimentin by protein kinase C coupled with the organization of intracellular membranes." J.Biol.Chem.(印刷中). (1996)

Takai, Y.：“蛋白激酶 C 与细胞内膜组织结合对波形蛋白进行有丝分裂特异性磷酸化。”（出版中）。

Kikuchi,H.: "Activation and possible involvement of calpain,a calciun-activated cysteine protease,in down-regulation of apoptosis of human monoblast U937 cells." Cell Death & Differentiation. 2. 195-199 (1995)

Kikuchi, H.：“钙蛋白酶（一种钙激活的半胱氨酸蛋白酶）的激活和可能参与下调人单核细胞 U937 细胞的凋亡。”

Murakami,A.: "Absence of down-regulation and translocation of the η isoform of protein kinase C in normal human keratinocytes." J.Invest.Dermatol.(印刷中). (1996)

Murakami, A.：“正常人角质形成细胞中蛋白激酶 C 亚型的下调和易位不存在。”J. Invest。（1996 年出版）。