ショウジョウバエの生殖細胞形成に関与する遺伝子の分裂酵母発現系を用いた機能解析

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ショウジョウバエの卵形成に必須のRNAヘリカーゼであるMe31B蛋白質は一次構造がste13と著しく類似しているのみならず、機能的にもste13変異を相補できる。Me13B蛋白質の細胞内機能を解明するため、本年度は次の研究を行った。1.in vitro突然変異による機能ドメインの解析ste13遺伝子をテンプレートにしたPCR法によりランダムに突然変異を誘起し、有性生殖欠損の表現型を示す多数のミスセンス変異を得た。これらの変異部位を決定したところ、2カ所の変異点がSte13/Me31Bにのみ高度に保存されたN末端領域にあることがわかった。この事実から、両タンパクに保存されたこの領域が蛋白質の機能に必須であることがわかった。2.Ste13/Me31B RNAヘリカーゼと相互作用する因子の同定in vitroで作製したste13ミスセンス変異株を親株として、この変異を抑圧するサプレッサーの単離と、同じくマルチコピーで相補しうるクローンの単離を並行して進めている。また、ste13変異株と同じ表現型を示す分裂酵母変異株を多数単離した。これらの遺伝解析から、ste13遺伝子とアレリックでない新しい遺伝子を2個(ste14,ste15)同定できた。現在これらの遺伝子のクローニングが進行中である。3.Ste13/Me31B蛋白質に対する抗体の作製と交差反応の検出抗Me31Bポリクローナル抗体がSte13蛋白質を認識しうるかどうかを分裂酵母抽出液のウエスタンブロットにより調べた。野生型分裂酵母では検出できなかったが、Ste13過剰発現株の抽出液を用いた場合は陽性のシグナルが認められた。また、大腸菌で発現させたGST-Ste13蛋白質は抗Me13B抗体と交差反応することがイムノブロット法で確かめられた。