权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

燐酸化ミオシンバイオセンサーを用いた細胞内燐酸化ミオシンの三次元解析

使用磷酸化肌球蛋白生物传感器对细胞内磷酸化肌球蛋白进行三维分析

基本信息

批准号：
09273211
负责人：
唐木英明
金额：
$ 1.6万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は、リン酸化ミオシン抗体を蛍光プローブでラベルし、その抗体特異性と抗体価の測定を行った。一方我々は、静止状態の血管平滑筋細胞において全カルモジュリンの95%以上が結合型として存在し、Ca結合タンパクとして機能できないことを明らかにしてきた。そこで、本年度は血管平滑筋細胞における遊離カルモジュリン量と細胞内Ca増加に伴う核へのトランスロケーションに対する各種ミュータントカルモジュリンの影響について検討した。【成果】1:共同研究者である瀬戸より供与されたリン酸化ミオシン特異的抗体をフルオレスセインアナログであるオレゴングリーン514にて蛍光ラベルした。牛気管平滑筋とニワトリ筋胃より天然アクトミオシンを抽出し、CaとEGTAで処理することにより、リン酸化ミオシンを含むサンプルと含まないサンプルを調整し、蛍光ラベルしたリン酸化ミオシン抗体の抗体特性と抗体価をウエスタンブロッティングを用いて検討をしたところ、リン酸化ミオシンのみがこの抗体により検出され、蛍光ラベルしない抗体と同等の抗体価と抗体特性を示した。従って、今後これがリン酸化ミオシンのバイオセンサーとして使用できるか検討する。2:C末端側の疎水性領域を変異させたM144R CaMの細胞質内での流動性は増加し、結合して不動性の分画は逆に減少した。従って、C末端側の疎水性領域がCaMのターゲット分子への結合に重要であることが示唆された。これに対して、イオノマイシンを用いて細胞内Caを増加させた際に認められるカルモジュリンの細胞質から核への移行は、N末端側の疎水性領域を変異させたM36L CaMで消失し、α螺旋構造の負に電化したアミノ酸残基を変異させたE82-84K CaMおよびE140Q CaMにおいても核への移行が低下した。以上の成績から、細胞内でのカルモジュリンの結合には特にC末端側の疎水性領域が重要であるが、核へのトランスロケーションにおいては、逆にN末端側の疎水性領域が特に重要であることが示唆された。

This year, the antibody specificity and antibody assay were tested. On the other hand, more than 95% of the entire cellular membrane in the smooth muscle cells of blood vessels in a resting state exists in a combined form, and the Ca-binding function becomes clear. This year, the effects of free calcium and intracellular calcium on vascular smooth muscle cells were studied. [Result] 1: Co-investigator: The antibody specific to the enzyme was isolated from the enzyme by 514 cells. In addition to the above, the invention also provides a method for determining the antibody properties of the antibody. The method comprises the following steps of: extracting the natural protein from the protein, adjusting the protein content, and adjusting the protein content. The characteristics of the antibody are shown in the table below. In the future, we'll discuss how to improve the quality of our products. 2. The C-terminal region of CaM was different, and the cytoplasmic fluidity of CaM increased, while the binding immobility decreased. The C-terminal region is important for the binding of CaM molecules. In addition, the intracellular Ca content in the N-terminal side of the cell increased, and the cytoplasmic nuclear migration in the N-terminal side of the cell decreased. M36L CaM disappeared, and the α-helix structure decreased. The above results show that the binding of intracellular proteins is especially important in the C-terminal water domain, and the binding of nuclear proteins is especially important in the N-terminal water domain.