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細胞内カルシウム/カルモジュリンの局在と機能

细胞内钙/钙调蛋白的定位和功能

基本信息

批准号：
10169212
负责人：
唐木英明
金额：
$ 1.02万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10169212/
关键词：
細胞内カルシウムカルモジュリン平滑筋細胞

项目摘要

我々はこれまでに、平滑筋細胞内に多量に存在するカルモジュリン(CaM)のうち、大部分(95%以上)が結合状態で存在するためにCaMとして機能できないこと、細胞内Caが増加するとそれに伴って遊離CaM量が増加すること、さらに持続的なCaの増加によってCaMが細胞質から核内へと移行することなど、CaMが細胞内でダイナミックに移動・局在することを明らかにしてきた。本研究では、4種の変異CaMを用いて、CaMの血管平滑筋細胞内での局在と移動に対する影響を検討し、さらに静止状態の細胞におけるCaMの結合分子の探索を行った。細胞内でのCaMの流動性を測定した結果、用いた変異CaMのうちM144R CaMとE140Q CaMは、野生型CaMに比べて蛍光回復速度が速かった。また、蛍光回復率はM144R CaMにおいてのみ対照のデキストランとほぼ同程度の蛍光回復率まで増大した。蛍光顕微鏡によるCaM動態の検索において、E82-84K CaMとE140Q CaMは静止状態での核内分布が低下した。また、イオノマイシン1μM投与による細胞質から核内へのCaMの移行はE82-84K CaMとE140Q CaMにおいて減弱し、M36L CaMにおいては消失したが、M144R CaMにおいては野生型CaM同様の核内への移行が認められた。以上の成績から細胞質でのCaMの結合にはC末端の疎水性領域とCa結合領域IVが重要であるのに対して、核へのCaMの移行と結合にはこれとは異なるN末端側の疎水性領域とα螺旋構造の負電荷のアミノ酸残基が重要であることが示唆された。そこで、次にCa非依存性のCaM結合分子を探索するために、Ca存在下あるいは非存在下でビオチンラベルしたCaMを用いてウエスト-ウエスタン法を試みた。その結果、ラット大動脈平滑筋細胞質分画より、約9種類のCa依存性のCaM結合蛋白質と5種類のCa非依存性のCaM結合蛋白質を検出した。細胞内において、静止状態においてもCaMの大部分が結合型の状態で存在していることから、Ca非依存性にCaMと結合する5種の分子が、生理的なCaMプールとして重要な機能を果たしている可能性が示唆された。

In the smooth muscle cells, a large amount of free CaM exists, and most of them (more than 95%) exist in a bound state. The free CaM function increases, and the intracellular Ca content increases. The free CaM content increases, and the intracellular Ca content increases. CaM is a cell that moves around and around. In this study, we investigated the effects of four different CaM binding molecules on the intracellular mobility of CaM in vascular smooth muscle cells and on quiescent CaM binding molecules. The mobility of CaM in cells was measured. The recovery rate of CaM in different CaM was faster than that in wild CaM. The light recovery rate of M144R CaM increases with the increase of the light recovery rate of M144R CaM The nuclear distribution of CaM in E82- 84K and E140Q is lower than that in static state. E82- 84K CaM and E140Q CaM were attenuated, M36L CaM disappeared, and M144R CaM was identified as the same type of CaM. The above results show that the binding of CaM in the cytoplasm is important in the C-terminal water domain and the Ca-binding domain IV. The binding of CaM in the nucleus is important in the N-terminal water domain and the negatively charged acid residues in the α-helix structure are important in the Ca-binding domain IV. CaM binding molecules in the presence or absence of Ca are explored using the CaM binding method. The results showed that 9 Ca-dependent CaM-binding proteins and 5 Ca-independent CaM-binding proteins were detected in smooth muscle cytoplasm. Most of the CaM in the intracellular and quiescent state exist in the binding state, Ca-independent CaM binding state, and the possibility of physiological CaM binding to important functions is demonstrated.