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ドミナント・ネガティブXlim1の構築と内在性Xlim-1の機能解析

显性失活Xlim1的构建及内源性Xlim-1的功能分析

基本信息

批准号：
09275207
负责人：
平良眞規
金额：
$ 1.54万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

Xlim-1の転写活性化領域をショウジョウバエのホメオドメイン蛋白質engrailedの転写抑制領域と置き変えたもの(Xlim1-enR)を作成した。またXlim1-enRの両LIMドメインの2重点変異体(3m-enR)、ホメオドメイン点変異体(HDm-enR)、両LIMドメイン・ホメオドメイン3重点変異体(3mHDm-enR)を作成した。それらのmRNAを4細胞期の背側帯域に微量注入したところXlim1-enRのみ高率に頭部を欠損した胚が得られた。この表現形はマウスのLim1ホモ変異体の表現形と良く一致していることより内在性のXlim-1の機能阻害によるものであるこが予想された。またそれぞれの変異体で活性が低下したことより、LIMドメインを介する蛋白質・蛋白質相互作用とホメオドメインのDNA結合に対する競合阻害により内在性Xlim-1が阻害されたと考えられ、LIMドメインへの蛋白質の結合によるXlim-1の活性化が標的遺伝子の発現に必要であるとの仮説を支持した。しかしXlim1-enRの阻害効果の特異性を調べるため野生型Xlim-1との共発現を行ったが正常胚への回復は認められなかった。その原因としては野生型Xlim-1の過剰発現による原腸陥入の阻害等の2次的作用による胚発生の異常が考えられた。そこでアニマルキャップの系を用い調べたところ、1)Xlim-1とLdb1により引き起こされるchordinの発現がXIim1-enRで抑制されること、2)アクチビンの誘導によるchordinの発現をXlim1-enRは抑制し、野生型Xlim-1は、完全ではないが、その抑制を解除することが示された。現在GRドメインを融合させた「条件付き」ドミナント・ネガティブXlim-1(GR-Xlim1-enR)作成を行っており、これにより発生時期特異的にかつ一過性に作用させることで、より特異性を持った機能阻害が可能になるのではないかと考えている。

Xlim-1's active domain is created by protein engineered and its inhibitory domain (Xlim-1-enR) is created. Xlim1-enR, HDm-enR are all created. Microinjection of mRNA into the dorsal region of the 4-cell cycle resulted in the loss of mRNA in the brain. The expression of this gene is different from that of the other gene, and the expression of this gene is different from that of the other gene. This study supports the theory that protein protein interactions and DNA binding in the LIM domain are essential for the development of protein targets. The specificity of Xlim-1-enR was modulated and the co-occurrence of wild-type Xlim-1 was observed. The reason for this is that the occurrence of wild type Xlim-1 is abnormal due to the secondary effect of protocol-induced inhibition. 1)Xlim-1 and Ldb1 are induced by chordin and inhibited by XIim1-enR; 2) Xlim1-enR is inhibited by chordin and wild-type Xlim-1 is completely inhibited by chordin and inhibited by chordin. Now GR-Xlim-1(GR-Xlim1-enR) is created by combining the "conditional payment" and the "conditional payment".