ドミナント・ネガティブXlim-1を用いた内在性Xlim-1の機能解析

使用显性失活 Xlim-1 对内源性 Xlim-1 进行功能分析

基本信息

批准号：
10171207
负责人：
平良眞規
金额：
$ 1.47万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

Xlim-1の転写活性化領域をengrailedの転写抑制領域と置き換えたドミナン卜・ネガティブ型コンストラクト(Xlim1-enR)をmRNA微量注入法によりオーガナイザー領域に発現させたところ、高率に頭部を欠損した胚が得られる。そこで分子マーカーを用いて脳の欠失部位を調べたところ、脳峡のマーカーen-2は消失し、後脳のマーカーのKro x20の発現は残ることより欠失領域は後脳より前方部分であることが判明した。この表現形はマウスのLim1ホモ変異体の表現形と良く一致していることより、内在性のXlim-1の機能阻害によるものと予想された。このことはXlim1-enRがXlim-1のin vivoでの転写因子としての機能を解析する上で有用な手段となり得ることを示している。そこでXlim1-enRによる阻害効果を背側中胚葉特異的分子マーカーで調べたところ、chordin、Otx2、cerberusの発現は強く抑制されることが示された。活性型Xlim-1はアニマルキャップにおいてchordinとOtx2の発現を引き起こすことは既に示されていたが、今回さらにcerberusの発現も引き起こすことが見い出され、これらの遺伝子はいずれもXlim-1の標的遺伝子の有力候補となった。昨年度に引き続きXlim1-enRの特異性を調べるために回復実験を試みた。Xlim1-enRと共注入するものとしては、活性型とxlim-1(LIMドメイン点変異体と欠失変異体)、野生型Xlim-1、野生型Xlim-1とLdb1、で行ったが、何れによっても回復は認められなかった。アニマルキャップアッセイにおいてアクチビン処理で引き起こされるchordinとcerberusの発現はXlim1-enRにより抑制されるが、野生型Xlim-1の共発現では回復するよりむしろ協調的に抑制が増強された。Xlim-1はLdb1と共に4量体を生成するとされているが、今回我々の得た結果はXlim-1がこの様な転写因子複合体として機能していることを示唆しており、今後のXlim-1の機能ドメインの詳細な解析の必要性を示している。

一个主要的负构建体（XLIM1-ENR），其中XLIM-1的转录激活区被mRNA微注射在组织者区域中替换为插入的转录抑制区域，从而在组织者区域表达，导致头部缺陷的胚胎比例很高。因此，当我们使用分子标记检查大脑缺失位点时，脑部峡谷标记器EN-2消失了，剩下后脑中的标记KRO X20的表达，发现已删除的区域在后脑脑的前面。该表型被预测是由于内源性抑制XLIM-1功能，因为它与小鼠LIM1同源物的表型非常吻合。这表明XLIM1-ENR可能是分析XLIM-1作为体内转录因子功能的有用工具。因此，使用特定于背侧中胚层的分子标记对XLIM1-ENR的抑制作用进行了检查，并表明Chordin，Otx2和Cerberus的表达得到了强烈抑制。已经表明，活跃的XLIM-1在动物帽中引起Chordin和OTX2的表达，但现在发现它会引起Cerberus的表达，并且这两个基因都成为XLIM-1靶基因的有前途的候选者。从去年开始，我们尝试了一个恢复实验来研究XLIM1-ENR的特异性。与XLIM1-ENR共同注射，使用活动形式，XLIM-1（LIM域突变体和缺失突变体），野生型XLIM-1，野生型XLIM-1和LDB1进行，但在任何一种情况下都均未恢复。 XLIM1-ENR抑制了由激活素治疗引起的Chordin和Cerberus的表达，但野生型XLIM-1的共表达协同增强了抑制作用而不是恢复。据说XLIM-1与LDB1一起产生四聚体，但是我们获得的结果表明，XLIM-1的功能是这种转录因子复合物，表明需要对XLIM-1功能域进行进一步详细的分析。