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オーガナイザーにおけるLIMホメオドメイン蛋白質Xlim-1の標的遺伝子の解析

组织器中LIM同源域蛋白Xlim-1的靶基因分析

基本信息

批准号：
11152207
负责人：
平良眞規
金额：
$ 0.7万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

アフリカツメガエルのオーガナイザーに発現するLIMホメオドメイン蛋白質Xlim-1は転写因子として働きオーガナイザーの前方型神経組織の誘導に関与していることが示唆されている。したがってXlim-1の標的遺伝子を明らかにすることはオーガナイザー活性を担う分子カスケードの一端を明らかにする上で非常に重要である。本研究では、Xlim-1の標的遺伝子候補の検索と、またその過程で見い出されたcerberus遺伝子のプロモーター解析を行った。(1)サブトラクション・ライブラリーを用いたXlim-1標的遺伝子候補の検索:活性型Xlim-1を発現させたアニマル・キャップを用いてサブトラクション・ライブラリーを作成し検索したところ10種の遺伝子を得た。全胚in situハイブリダイゼーションで発現領域を検討した結果、5つ遺伝子がオーガナイザー領域に発現し、その中に頭部誘導因子Cerberusの遺伝子が含まれていた。(2)cerberus遺伝子のプロモーター解析:cerberusのゲノム遺伝子プロモーター領域を単離しpGL3-basicベクターに組み込み、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとしたレポーター・コンストラクトcer/Lucを作成した。cer/Lucと活性型Xlim-1 mRNAをアフリカツメガエル2細胞期の動物極側に顕微注入し、胞胚期でアニマル・キャップを切除し、原腸胚期でルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、(i)活性型Xlim-1により強く活性化されること、(ii)反応領域は0.58kbで十分であること、(iii)その領域にXlim-1の結合配列である多数のTAATコアモチーフが存在すること、(iv)-0.22から-0.12を欠失すると反応性が消失すること、が明かとなった。これらの結果はcerberusがXlim-1の直接の標的遺伝子であること、およびXlim-1のオーガナイザー機能への関与の少なくとも一部はcerberusの発現を介していることを示唆している。

The LIM protein Xlim-1 is related to the induction of the anterior nervous system tissue. Xlim-1's target gene is very important for its activity. In this study, the detection and analysis of Xlim-1 target candidates were performed. (1)Xlim-1 target gene candidate search: active Xlim-1 is found in the middle of the search, and 10 kinds of gene candidates are found. The whole embryo in situ is found in the field of detection. The results show that 5 genes are found in the field of detection. The genes of Cerberus are found in the middle of the field. (2)Cerberus gene analysis:cerberus gene analysis:cerberus gene analysis: cer Cer/Luc-1 mRNA activity was measured at the 2-cell stage by microinjection, cytoembryonic stage by excision, and gastrula stage by PCR. The results are as follows: (i) Active Xlim-1 is strongly activated;(ii) Reverse domain is 0.58 kb;(iii) Most TAAT is present in the binding alignment of Xlim-1 in all domains;(iv)-0.22 °-0.12 °-0.22 °-0.12 °-0.1 The result of this is that cerberus and Xlim-1 are directly related to the function of Xlim-1, and some are related to the occurrence of cerberus.