Xlim-1の活性制御機構と他の転写因子との相互作用

Xlim-1活性控制机制及与其他转录因子的相互作用

• 批准号: 11154205
• 负责人: 平良 眞規
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11154205/
• 关键词: 脊椎動物; アフリカツメガエル; 発生; オーガナイザー; 胚誘導; ホメオボックス遺伝子; LIMドメイン; Xlim-1

アフリカツメガエルのシュペーマン・オーガナイザーに特異的に発現するLIMホメオドメイン蛋白質Xlim-1はオーガナイザーおいて重要な役割を担っている転写因子であり、ホメオドメインのN末側に存在する一対のLIMドメインは負の制御ドメインとして機能することが示唆されている。本研究ではXlim-1の活性化機構を明らかにするための基礎として、LIMドメインによる自己抑制機構と転写因子間相互作用についての検討を目指した。(1)酵母two hybrid systemによる解析:Xlim-1を4領域(AB,L60,HE,CT)に分け、種々の領域あるいは全長Xlim-1をGAL4-DBD(以下DBD)またはGAL4-AD(以下AD)に融合させたものを用いて相互作用を検討した。その結果、いずれの組み合わせでも強い相互作用を示す結果は得られなかったが、ADとホメオドメイン(HD)を含む領域をもつ融合蛋白質はHDによると考えられる弱いガラクトシダーゼ活性を示し、その活性がDBD-ABLHDおよびDBD-ABL60により抑制されることがわかった。このことからABL60の領域(LIMドメインとリンカー部)がHDのDNAへの結合を抑制したことが考えられた。(2)GST pull down法による解析:直接的な蛋白質結合を検討するため、GSTとXlim-1の各領域との融合蛋白質と[35S]標識したXlim-1あるいは各領域を用いて解析を行った。その結果、ABL60の領域は、HD27(HDとそれに続く27アミノ酸)に直接結合することが示された。この結果は酵母two hybrid systemで示唆された結論と良く一致している。したがってLIMドメインによる自己抑制機構は分子内相互作用によると考えられる。(3)転写因子間相互作用の検討:FLAGダグXlim-1をアフリカツメガエル胚に発現させ、その胚抽出液を用いてEMSAを行った。その結果Xlim-1の結合部位UEを含む標識オリゴDNAでDNA-蛋白質複合体のバンドを得た。標識しないUEオリゴよる競合的阻害と抗FLAG抗体によるsuper-shiftにより、Xlim-1が特異的にUEに結合することが示された。この系が確立したことより今後転写因子間の相互作用の検討が可能となった。

The LIM protein Xlim-1 is a protein that is specific to the N-terminal side of the protein. The LIM protein Xlim-1 is a protein that is specific to the N-terminal side of the protein. This study aims to investigate the mechanism of activation of Xlim-1, its basis, its inhibition mechanism and the interaction between factors. (1)Yeast two hybrid system analysis:Xlim-1 4 domain (AB,L60,HE,CT) to divide, seed and domain, full length Xlim-1 GAL4-DBD(DBD) to GAL4-AD(AD) to fuse and use interaction to discuss. The results showed that the strong interaction between the two groups was inhibited by the activity of DBD-ABLHD and DBD-ABL60, which was inhibited by the activity of DBD-ABLHD. ABL60 domain (LIM) and HD DNA binding inhibition (2)GST pull-down analysis: direct protein binding analysis, GST and Xlim-1 fusion proteins in various domains,[35S] identification and Xlim-1 analysis in various domains. As a result, ABL60 and HD27(HD) were directly combined. The results show that the two hybrid systems are consistent. The mechanism of self-inhibition is the intramolecular interaction. (3)Study on the interaction between the two factors:FLAG The binding site UE of Xlim-1 was identified by DNA and DNA-protein complex. The identification of competing anti-FLAG antibodies and the identification of Xlim-1 specific anti-FLAG antibodies This system is established and the interaction between the future writing factors is discussed.

项目成果

平良眞規(分担): "実験医学 転写因子研究 1999"羊土社. 10 (1999)

Masaki Taira（撰稿人）：《实验医学转录因子研究 1999》Yodosha 10 (1999)。

Zhao, Y., et al.: "Control of hippocampal morphogenesis and neuronal differentiation by the LIM homeobox gene Lhx5"Science. 284. 1155-1158 (1999)

赵，Y.，等人：“LIM 同源盒基因 Lhx5 对海马形态发生和神经元分化的控制”科学。