Xlim-1の活性制御機構と他の転写因子との相互作用

Xlim-1活性控制机制及与其他转录因子的相互作用

基本信息

批准号：
11154205
负责人：
平良眞規
金额：
$ 0.96万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

アフリカツメガエルのシュペーマン・オーガナイザーに特異的に発現するLIMホメオドメイン蛋白質Xlim-1はオーガナイザーおいて重要な役割を担っている転写因子であり、ホメオドメインのN末側に存在する一対のLIMドメインは負の制御ドメインとして機能することが示唆されている。本研究ではXlim-1の活性化機構を明らかにするための基礎として、LIMドメインによる自己抑制機構と転写因子間相互作用についての検討を目指した。(1)酵母two hybrid systemによる解析:Xlim-1を4領域(AB,L60,HE,CT)に分け、種々の領域あるいは全長Xlim-1をGAL4-DBD(以下DBD)またはGAL4-AD(以下AD)に融合させたものを用いて相互作用を検討した。その結果、いずれの組み合わせでも強い相互作用を示す結果は得られなかったが、ADとホメオドメイン(HD)を含む領域をもつ融合蛋白質はHDによると考えられる弱いガラクトシダーゼ活性を示し、その活性がDBD-ABLHDおよびDBD-ABL60により抑制されることがわかった。このことからABL60の領域(LIMドメインとリンカー部)がHDのDNAへの結合を抑制したことが考えられた。(2)GST pull down法による解析:直接的な蛋白質結合を検討するため、GSTとXlim-1の各領域との融合蛋白質と[35S]標識したXlim-1あるいは各領域を用いて解析を行った。その結果、ABL60の領域は、HD27(HDとそれに続く27アミノ酸)に直接結合することが示された。この結果は酵母two hybrid systemで示唆された結論と良く一致している。したがってLIMドメインによる自己抑制機構は分子内相互作用によると考えられる。(3)転写因子間相互作用の検討:FLAGダグXlim-1をアフリカツメガエル胚に発現させ、その胚抽出液を用いてEMSAを行った。その結果Xlim-1の結合部位UEを含む標識オリゴDNAでDNA-蛋白質複合体のバンドを得た。標識しないUEオリゴよる競合的阻害と抗FLAG抗体によるsuper-shiftにより、Xlim-1が特異的にUEに結合することが示された。この系が確立したことより今後転写因子間の相互作用の検討が可能となった。

XLIM-1是一种在Xenopusspémann组织器中特异性表达的LIM同源域蛋白，是一个转录因子，在组织者中起着重要作用，表明同源域N-terminus中存在的一对LIM域作用起负调控域。这项研究旨在研究LIM结构域的自动放量机理以及转录因子之间的相互作用，以此作为阐明XLIM-1激活机制的基础。（1）使用酵母两种混合系统：XLIM-1分为四个区域（AB，L60，HE，CT），并使用各个区域或将全长XLIM-1融合到GAL4-DBD（以下称为DBD）或GAL4-AD（以下称为AD）进行了研究。结果没有显示出与两种组合的强烈相互作用的结果，但是发现与含有AD和同源域（HD）区域的融合蛋白表现出弱半乳糖苷酶活性，认为弱的半乳糖苷酶活性被认为是由HD引起的，并且该活性被DBD-ABLHD和DBD-ABL60抑制。这表明ABL60（LIM结构域和接头部分）的区域抑制了HD与DNA的结合。（2）通过GST下拉方法分析：为了研究直接蛋白结合，使用GST和XLIM-1区域的融合蛋白以及[35S]标记的XLIM-1或每个区域进行了分析。结果表明，ABL60的区域直接与HD27结合（HD和27个氨基酸）。该结果与酵母二杂种系统提出的结论非常吻合。因此，LIM结构域的自动压缩机制被认为是由于分子内相互作用所致。（3）转录因子相互作用的检查：使用胚胎提取物在Xenopus Embryos中表达FLAG Doug Xlim-1。结果，用含有Xlim-1的结合位点UE的标记寡素体获得了DNA蛋白复合物的带。未标记的UE寡聚抗体和抗Flag抗体的竞争性抑制作用表明XLIM-1专门与UE结合。该系统的建立使未来调查转录因子之间的相互作用成为可能。