核内レセプターの高次機能の解析

核受体高阶功能分析

• 批准号: 09277207
• 负责人: 加藤 茂明
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09277207/
• 关键词: 標的組換えマウス; 脂溶性ビタミンレセプター; ビタミンD標的遺伝子; リガンド結合; mammalian two-hybrid法; 共役転写因子; yeast two-hybrid法

本研究では以下の4点に焦点を当て、核内レセプターの高次機能を明らかにする目的で標的組換えマウスを用い解析を行った。また核内レセプターの細胞核内での機能を明確にする目的で、核内レセプターのリガンド結合による構造変化の解析、及びこの変化を認識する共役因子の同定を行なった。1)脂溶性ビタミンレセプターの高次機能の解析:脂溶性ビタミンDレセプター(VDR)は1種、ビタミンAには6種のレセプター(RARa,b,g及びRXRa,b,g)が存在する。VDRはホモ2量体もしくはRXRa,b,gのいずれかとヘテロ2量体を形成し、ビタミンD標的遺伝子の転写を制御する。このVDR KOマウスは授乳期以降にのみ障害を示すことが明らかになった他、性生殖系に障害がみられ、全く予期されなかった表現型がみられ更に解析を進めた。2)核内レセプターのリガンド結合による構造変化:核内レセプターはリガンド結合により転写促進能を得るが、この際レセプターの立体構造変化を伴うと考えられている。特にレセプターN末端とC末端に存在する2箇所の転写促進領域はリガンド結合依存的な機能上の相互作用が予想されている。そこでERのAF-1、AF-2の相互作用をyeast、mammalian two-hybrid法にて検討し、さらに相互作用する領域を同定した。3)核内レセプターの共役転写因子の検索:ER、VDR、アンドロゲンレセプター(AR)、ミネラルコルチコイド(MR)のAF-1、AF-2をプローブに、yeast two-hybrid法にて各種cDNAライブラリーから共役因子を検索した。特にER、ARのAF-1蛋白を細胞内で大量発現させ、結合する核内因子を生化学的に精製した。4)細胞周期と核内レセプター機能との相関:ER及びARの、AF-1とAF-2への細胞周期特異的なキナーゼ(サイクリン/CDK等)によるリン酸化の可能性を探った。

这项研究的重点是以下四个点，并使用靶向重组小鼠进行了分析，以阐明核受体的较高功能。此外，为了阐明核受体在细胞核中的功能，我们分析了由核受体的配体结合引起的结构变化，并确定了识别这些变化的共价因子。 1）分析脂溶性维生素受体的较高功能：有一种类型的脂溶性维生素D受体（VDR）和六种类型的维生素A（RARA，B，G和RXRA，RXRA，B，G）。 VDR与同型二聚体或RXRA，B，G形成异二聚体，并调节维生素D靶基因的转录。发现这些VDR KO小鼠仅在泌乳后才表现出疾病，并且在性生殖系统中也患有疾病，从而导致意外的表型，并进行了进一步的分析。 2）由于核受体的配体结合而引起的结构变化：核受体通过配体结合获得转录促进能力，并被认为涉及受体的构象变化。特别是，受体的N末端和C末端存在的两个转录促进区有望具有配体结合依赖性的功能相互作用。因此，使用酵母和哺乳动物的两杂化方法检查了ER中AF-1和AF-2之间的相互作用，并进一步鉴定了相互作用的区域。 3）搜索核受体的共轭转录因子：使用ER，VDR，雄激素受体（AR）和矿体皮质激素（MR）AF-1和AF-2探针，使用酵母两杂化方法从各种cDNA文库中搜索耦合因子。特别是，ER和AR的AF-1蛋白在细胞中大量表达，并且结合核因子在生化上纯化。 4）细胞周期与核受体功能之间的相关性：我们通过细胞周期特异性激酶（例如细胞周期蛋白/CDK）与AF-1和AF-2探索了ER和AR磷酸化的可能性。

项目成果

Yoshizawa,T., Kato,S., et al.: "Impaired bone formation and uterine hypoplasia with growth retardation after weaning in mice lacking the vitamin D receptor." Nature Genetics. 16. 391-396 (1997)

Yoshizawa,T.、Kato,S. 等人：“缺乏维生素 D 受体的小鼠断奶后骨形成受损、子宫发育不全并伴有生长迟缓。”

Takeyama,K., Kato,S., et al.: "25-Hydroxyvitamin D_3 1α-hydroxylase and vitamin D synthesis." Science. 277. 1827-1830 (1997)

Takeyama, K.、Kato, S. 等人：“25-羟基维生素 D_3 1α-羟化酶和维生素 D 合成。科学”277。1827-1830 (1997)

Yamauchi,J., Kato,S., et al.: "Two forms of avian (chicken) TATA-binding protein mRNA generated by alternative polyadenylation." Biochem.Biophys.Res.Commun.234. 406-411 (1997)

Yamauchi,J.、Kato,S. 等人：“通过选择性多聚腺苷酸化生成两种形式的禽类（鸡）TATA 结合蛋白 mRNA。”

Kitanaka,S., Kato,S., et al.: "A new compound heterozygous mutation in the 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 gene in a case of apparent mineralocorticoid excess." J.Clin.Endocrinol.Metab.82. 4054-4058 (1997)

Kitanaka,S.、Kato,S. 等人：“在盐皮质激素明显过量的情况下，11β-羟基类固醇脱氢酶 2 型基因出现新的复合杂合突变。”J.Clin.Endocrinol.Metab.82-。 4058 (1997)

Fujii,H., Kato,S., et al.: "Metabolic inactivation of retinoic acid by a novel P450 differentially expressed in developing mouse embryos." EMBOJ.16. 4163-4173 (1997)

Fujii,H., Kato,S., et al.：“在发育中的小鼠胚胎中差异表达的新型 P450 使视黄酸代谢失活。”