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制御機能をもつ耐熱性酵素の設計と応用

具有调控功能的耐热酶的设计及应用

基本信息

批准号：
02205063
负责人：
左右田健次
金额：
$ 0.83万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

アラニンラセマ-ゼの2個のドメイン間をつなぐヒンジ領域に対応する部位で本酵素遺伝子を切断し、プラスミド、pARSD2を作製した。本プラスミドを持つ大腸菌JM109クロ-ン株よりアラニンラセマ-ゼを精製した。本酵素は30Kと14Kの大小2種のポリペプチドより構成されており、各ポリペプチドの大きさはそれぞれの遺伝子から予想される大きさによく一致した。本分断型変異酵素は熱に対して安定であるが、野生型酵素よりは若干不安定であった。分断型変異酵素のゲルろ過クロマトグラフィ-を行うと、野生型酵素と同じ位置に溶出された。また、オクタロニ-二重拡散法において両酵素は不可分の免疫化学的性質を質した。円偏光二色性スペクトルも互いに非常に近似していた。両酵とも420nm付近に結合補酵素、ピリドキサルリン酸に由来する負の円偏光二色性バンドを示すが、分断型変異酵素は野生型酵素に比べピ-クの高さが小さい。分断型変異酵素の活性中心は微視的には野生型酵素のそれとは異なった構造をしており、それが円偏光二色性スペクトルの微妙な違いとなって観察されたものと考えられる。6M塩酸グアニジンで分断型変異酵素を変性させた後、塩酸グアニジンを含まない緩衝液で希釈したが、活性の回復は認められなかった。しかし、塩酸グアニジンを含まない緩衝液に対して透析を行うと、活性が回復した。4M塩酸グアニジン存在下でゲルろ過を行い、各ドメインに相当するポリペプチドを単離した。塩酸グアニジンを除去した後、両者を混合したが、活性の回復は認められなかった。しかし、6M塩酸グアニジンで変性させた後、両者を等量混合し透析すると、両者を解離させる前と同程度まで活性が回復した。従って、変性後の再生には両ドメインが同時に存在することが必要であることが明らかになった。

The enzyme gene is cut off, pressed down and pARSD2 is controlled between the two sites in the field. This is the first time that E. coli JM109 has been isolated. The enzyme consists of two kinds of different sizes from 30K to 14K. The sub-type enzyme is stable, and the wild-type enzyme is unstable. Dissociation of different enzymes in different positions The enzyme is characterized by its inseparable immunochemical properties. Polarized dichroism is a very close approximation of color. The enzyme activity of the 420nm binding enzyme was lower than that of the wild-type enzyme activity. The active center of the dissociative enzyme is microscopically Weishi app from that of the wild-type enzyme, and the structure of the enzyme is different from that of the polarized dichroic enzyme. 6. The activity of the enzyme was determined by the reaction time of the enzyme. A buffer solution for dialysis is available. 4. In the presence of acid, it is necessary to select the appropriate route for each route. After the acid is removed, the mixture is recovered. 6. The activity of the enzyme was recovered after the enzyme was dissolved in the same amount. It is necessary for the regeneration of the nature to occur.