制御機能をもつ耐熱性酵素の設計と応用

具有调控功能的耐热酶的设计及应用

基本信息

批准号：
02205063
负责人：
左右田健次
金额：
$ 0.83万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

アラニンラセマ-ゼの2個のドメイン間をつなぐヒンジ領域に対応する部位で本酵素遺伝子を切断し、プラスミド、pARSD2を作製した。本プラスミドを持つ大腸菌JM109クロ-ン株よりアラニンラセマ-ゼを精製した。本酵素は30Kと14Kの大小2種のポリペプチドより構成されており、各ポリペプチドの大きさはそれぞれの遺伝子から予想される大きさによく一致した。本分断型変異酵素は熱に対して安定であるが、野生型酵素よりは若干不安定であった。分断型変異酵素のゲルろ過クロマトグラフィ-を行うと、野生型酵素と同じ位置に溶出された。また、オクタロニ-二重拡散法において両酵素は不可分の免疫化学的性質を質した。円偏光二色性スペクトルも互いに非常に近似していた。両酵とも420nm付近に結合補酵素、ピリドキサルリン酸に由来する負の円偏光二色性バンドを示すが、分断型変異酵素は野生型酵素に比べピ-クの高さが小さい。分断型変異酵素の活性中心は微視的には野生型酵素のそれとは異なった構造をしており、それが円偏光二色性スペクトルの微妙な違いとなって観察されたものと考えられる。6M塩酸グアニジンで分断型変異酵素を変性させた後、塩酸グアニジンを含まない緩衝液で希釈したが、活性の回復は認められなかった。しかし、塩酸グアニジンを含まない緩衝液に対して透析を行うと、活性が回復した。4M塩酸グアニジン存在下でゲルろ過を行い、各ドメインに相当するポリペプチドを単離した。塩酸グアニジンを除去した後、両者を混合したが、活性の回復は認められなかった。しかし、6M塩酸グアニジンで変性させた後、両者を等量混合し透析すると、両者を解離させる前と同程度まで活性が回復した。従って、変性後の再生には両ドメインが同時に存在することが必要であることが明らかになった。

将酶基因裂解在与连接丙氨酸种族酶两个结构域的铰链区域的位点上切割，并产生了质粒PARSD2。从带有该质粒的大肠杆菌JM109克隆菌株中纯化丙氨酸种族友酶。该酶由两个大和小多肽组成，分别为30K和14K，每个多肽的大小与相应基因预测的大小一致。这种分裂的突变酶是热稳定的，但比野生型酶稍微不稳定。进行分裂突变酶的凝胶过滤色谱法，并将酶在与野生型酶相同的位置洗脱。此外，在Octaloni双扩散法中，这两种酶均表现出不可分割的免疫化学特性。圆形的二色性光谱也非常接近。两种发酵都显示出源自结合辅酶，吡啶多磷酸盐，约420 nm的负圆形二分法带，但裂开型突变酶的峰高度小于野生型酶。分裂突变酶的活性中心具有与野生型酶不同的显微镜结构，并且认为这被认为是圆形二色性谱系的微妙差异。在用盐酸6M鸟嘌呤定位分裂的突变酶后，将酶用含有含盐酸鸟嘌呤的缓冲液稀释，但未观察到活性的恢复。但是，当对含有无盐酸鸟嘌呤的缓冲液进行透析时，恢复了活性。在4M盐酸盐水存在下进行凝胶过滤，以分离与每个结构域相对应的多肽。除去盐酸盐碱后，将两者混合在一起，但没有观察到活性的恢复。但是，在用盐酸6M鸟嘌呤定性后，将两者以等量的量混合并透析以将活性恢复到与两者分离之前相同的水平。因此，已经揭示了两个域在变性后必须同时存在以进行再生。