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制御機能をもつ耐熱性酵素の設計と応用

具有调控功能的耐热酶的设计及应用

基本信息

批准号：
03205067
负责人：
左右田健次
金额：
$ 0.83万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

フェニルアラニン脱水素酵素はフェニルアラニンの可逆的脱水素反応を触媒するNAD要求性の酵素である。好熱性放線菌、Thermoactinomyces intermediusの本酵素の1次構造は、Bacillus stearothermophilusの耐熱性ロイシン脱水素酵素の一次構造に対して47.1%の相同性を示し、特に、180番から220番のアミノ酸残基の間に相同性の高い特徴的な配列がみられた。いずれもGlyーXーGlyーXーXーGlyー(X)1_0-Glyー(X)6_-Aspという配列を含んでいた。この領域はNAD結合ドメインを構成していると考えられた。また、60番から120番のアミノ酸残基の間にも特徴的な配列がみられ、両酵素の1次構造の相同性は極めて高い。特に、80番付近にGlyーGlyーGlyーLysという配列が存在し、この領域は基質結合ドメインを構成していると考えられた。そこで、実際にこのようなドメイン構造が存在するかどうかを明らかにするために、酵素の限定分解を行った。耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素をズブチリシンで処理したところ、相異なる分子量を持つ2種の主要なタンパク質断片に分解された。それぞれのN末端配列を解析したところ、本酵素は主にThr147とSer148の間で限定分解を受けていることが明らかになった。一方、耐熱性ロイシン脱水素酵素の場合にはこのような結果を得ことができなかった。両酵素の基質特異性は明白に異なるけれども、1次構造上の相同性が高いこと、NADH水素転移の立体化学がいずれもB型であるなどの理由により、両酵素は互いに極めて類似した立体構造を持つと予想された。耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素においてはN末端ドメインに基質結合部位が存在し、C末端ドメインにNAD結合部位が存在すると考えられた。ロイシン脱水素酵素のN末端ドメインとフェニルアラニン脱水素酵素のC末端ドメインを遺伝子工学的手法を用いて結合させ、キメラ遺伝子を構築し、活性を持つキメラタンパク質を発現させるのに成功した。

A reversible dehydro enzyme that catalyzes the NAD requirement. The primary structure of this enzyme from thermophilic actinomycetes, Thermoactinomyces intermedius, and Bacillus stearothermophilus showed identity of 47.1%, and the sequence of acid residues from 180 to 220 showed high identity. Gly <$X <$Gly <$(X)1_0-Gly <$(X)6_-Asp <$ This domain is composed of NAD and NAD. The sequence of the characteristic amino acid residues between the 60-fold and 120-fold amino acid residues is very similar to that of the primary structure of the enzyme Special, 80-fold close to Gly-Gly-Lys, the array exists, and the matrix is combined with the composition. The structure of the enzyme exists in the real world. Heat resistance, heat resistance N-terminal sequence analysis, the enzyme between Thr147 and Ser148 A party, heat resistance, dehydration enzyme in the case of the results of the two The substrate specificity of the enzyme is different, the identity of the primary structure is high, the stereochemistry of NADH is different from that of the B type, and the stereostructure of the enzyme is similar to that of the B type. The substrate binding site exists at the N-terminal end and the NAD binding site exists at the C-terminal end of the enzyme. The N-terminal region of the dehydro enzyme was successfully constructed and its activity was maintained by means of gene engineering in combination with the C-terminal region of the dehydro enzyme.