制御機能をもつ耐熱性酵素の設計と応用

具有调控功能的耐热酶的设计及应用

基本信息

批准号：
03205067
负责人：
左右田健次
金额：
$ 0.83万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

フェニルアラニン脱水素酵素はフェニルアラニンの可逆的脱水素反応を触媒するNAD要求性の酵素である。好熱性放線菌、Thermoactinomyces intermediusの本酵素の1次構造は、Bacillus stearothermophilusの耐熱性ロイシン脱水素酵素の一次構造に対して47.1%の相同性を示し、特に、180番から220番のアミノ酸残基の間に相同性の高い特徴的な配列がみられた。いずれもGlyーXーGlyーXーXーGlyー(X)1_0-Glyー(X)6_-Aspという配列を含んでいた。この領域はNAD結合ドメインを構成していると考えられた。また、60番から120番のアミノ酸残基の間にも特徴的な配列がみられ、両酵素の1次構造の相同性は極めて高い。特に、80番付近にGlyーGlyーGlyーLysという配列が存在し、この領域は基質結合ドメインを構成していると考えられた。そこで、実際にこのようなドメイン構造が存在するかどうかを明らかにするために、酵素の限定分解を行った。耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素をズブチリシンで処理したところ、相異なる分子量を持つ2種の主要なタンパク質断片に分解された。それぞれのN末端配列を解析したところ、本酵素は主にThr147とSer148の間で限定分解を受けていることが明らかになった。一方、耐熱性ロイシン脱水素酵素の場合にはこのような結果を得ことができなかった。両酵素の基質特異性は明白に異なるけれども、1次構造上の相同性が高いこと、NADH水素転移の立体化学がいずれもB型であるなどの理由により、両酵素は互いに極めて類似した立体構造を持つと予想された。耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素においてはN末端ドメインに基質結合部位が存在し、C末端ドメインにNAD結合部位が存在すると考えられた。ロイシン脱水素酵素のN末端ドメインとフェニルアラニン脱水素酵素のC末端ドメインを遺伝子工学的手法を用いて結合させ、キメラ遺伝子を構築し、活性を持つキメラタンパク質を発現させるのに成功した。

苯丙氨酸脱氢酶是一种NAD需要的酶，可催化苯丙氨酸的可逆脱氢作用。嗜热性放线菌的酶Intermedius酶的主要结构，热分离菌Intermedius，表现出47.1％的同源性，与抗热型遗传性持续性脱氢酶的主要结构同源性，特别是在氨基酸含量180至220之间具有高氨基酸残基之间的特征性序列，尤其是具有高氨基酸残基之间的特征性序列。所有这些都包含序列Gly-X-Gly-X-X-Gly-（x）1_0-gly-（x）6_-asp。人们认为该地区构成了NAD结合领域。此外，在60至120的氨基酸残基之间也发现了一个独特的序列，两种酶的主要结构的同源性非常高。特别是，有一个序列称为Gly-Gly-Gly-Lys在数字80左右，该区域被认为构成了底物结合域。因此，为了阐明这种域结构是否真正存在，进行了有限的酶降解。用枯草蛋白处理热耐热苯丙氨酸脱氢酶，并将其降解为具有不同分子量的两个主要蛋白质片段。对每个序列的N末端序列的分析表明，该酶经历了有限的降解，主要在THR147和SER148之间。另一方面，在耐热亮氨酸脱氢酶的情况下，无法获得此类结果。 Although the substrate specificity of both enzymes is clearly different, it was predicted that the enzymes have very similar conformations to each other due to their high primary structure homology and the stereochemistry of NADH hydrogen transfer in both form B. In the thermo-resistant phenylalanine dehydrogenase, a substrate binding site was thought to exist in the N-terminal domain, and a NAD binding site was thought to exist in the C-terminal 领域。亮氨酸脱氢酶的N末端结构域和苯丙氨酸脱氢酶的C末端结构域使用基因工程方法组合来构建嵌合基因并成功地表达了活性嵌合蛋白。