ハロ酸分解系酵素の遺伝子工学的解析と応用

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2-ハロ酸の加水分解的脱ハロゲンを解媒する2-ハロ酸デハロゲナーゼ(DEX)の構造と機能を解析した。1.土壌細菌Pseudomonas sp.YLから耐熱性L-DEX(2-ハロ酸のL体に特異的に作用し、D-2-ヒドロキシ酸を与える)を精製し、これが炭酸鎖長2から16の種々の基質に作用することを明らかにした。2.L-DEX遺伝子の塩基配列を決定し、これが、他生物由来のL-DEX及びハロ酢酸デハロゲナーゼと38-57%の高い相同性を示すこと、また、立体特異性を異にするD-DEXや、基質特異性を異にするハロアルカンデハロゲナーゼとは有意な相同性がないことを明らかにした。Pseudomonas sp.113のDL-DEX(2-ハロ酸のDL両異性体に作用し、立体反転で2-ヒドロキシ酸を与える)の遺伝子のクローン化にも成功し、現在構造解析を行っている。3.クローン化したL-DEX遺伝子を、Escherichia coliJM109に導入し、L-DEXが全可溶蛋白質の約50%を占める高発現株を取得した。この組換え体から、熱処理とイオン交換クロマトグラフィーのみで簡便に本酵素を均一に精製する方法を確立した。4.3.で大量に精製した酵素を用い、良質な単斜晶系の結晶を得ることができた。X線回折データを収集し、現在、解析を行っている。5.L-DEXはAsp,Glu,Arg,Tyrの化学修飾で失活した。他生物由来のL-DEXとの間で完全に保存されているAsp,Glu,Arg,Tyrを部位特異的変異法により、Asn,Glu,Lys,Pheにそれぞれ改変した。その結果、10位及び180位のAsp残基、41位のArg残基、157位のTyr残基を改変した変異酵素において著しい活性低下が認められ、これらの触媒反応への関与が示唆された。