权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

ハロ酸分解系酵素の遺伝子工学的解析と応用

卤酸降解酶的基因工程分析及应用

基本信息

批准号：
05278231
负责人：
左右田健次
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

2-ハロ酸の加水分解的脱ハロゲンを解媒する2-ハロ酸デハロゲナーゼ(DEX)の構造と機能を解析した。1.土壌細菌Pseudomonas sp.YLから耐熱性L-DEX(2-ハロ酸のL体に特異的に作用し、D-2-ヒドロキシ酸を与える)を精製し、これが炭酸鎖長2から16の種々の基質に作用することを明らかにした。2.L-DEX遺伝子の塩基配列を決定し、これが、他生物由来のL-DEX及びハロ酢酸デハロゲナーゼと38-57%の高い相同性を示すこと、また、立体特異性を異にするD-DEXや、基質特異性を異にするハロアルカンデハロゲナーゼとは有意な相同性がないことを明らかにした。Pseudomonas sp.113のDL-DEX(2-ハロ酸のDL両異性体に作用し、立体反転で2-ヒドロキシ酸を与える)の遺伝子のクローン化にも成功し、現在構造解析を行っている。3.クローン化したL-DEX遺伝子を、Escherichia coliJM109に導入し、L-DEXが全可溶蛋白質の約50%を占める高発現株を取得した。この組換え体から、熱処理とイオン交換クロマトグラフィーのみで簡便に本酵素を均一に精製する方法を確立した。4.3.で大量に精製した酵素を用い、良質な単斜晶系の結晶を得ることができた。X線回折データを収集し、現在、解析を行っている。5.L-DEXはAsp,Glu,Arg,Tyrの化学修飾で失活した。他生物由来のL-DEXとの間で完全に保存されているAsp,Glu,Arg,Tyrを部位特異的変異法により、Asn,Glu,Lys,Pheにそれぞれ改変した。その結果、10位及び180位のAsp残基、41位のArg残基、157位のTyr残基を改変した変異酵素において著しい活性低下が認められ、これらの触媒反応への関与が示唆された。

The structure and function of 2-Hydroic acid, which is hydrolyzed by dehydration, is analyzed by dehydration of 2-Hydroic acid. 1. Pseudomonas sp.YL からHeat resistance L-DEX (specific に effect of 2-ハロ acid のL body, D-2-ヒドロキシ acidをAnd える)をRefined し, これがcarbonic acid lock length 2から16のkind of 々のbase にeffect することを明らかにした. 2. L-DEX has a high degree of homogeneity and high homogeneity of 38-57%.と, また, Stereospecific をisoにするD-DEXや, Matrix-specific をisoにするハロアルカンデハロゲナーゼとは intentional な Sameness がないことを明らかにした. Pseudomonas sp.113 DL-DEX The ドロキシ acid を and える)の伝子のクローン化にもsuccessfulし, the current structure analysis を行っている. 3. About 50% of L-DEX fully soluble protein has been obtained from Escherichia coli JM109 and L-DEX has been introduced. The combination of the body and the heat treatment of the body and the heat treatment of the enzyme are simple and easy, and the enzyme is uniform and refined, and the method is established. 4.3. Use a large amount of refined enzymes and use high-quality clinic crystals. The X-ray return is collected and analyzed now. 5. L-DEX can be chemically modified and inactivated by Asp, Glu, Arg, Tyr. The origin of his biological origin is L-DEX, which is completely preserved. Asp, Glu, Arg, Tyr are part-specific modification methods. The result, the Asp residue at position 10 and position 180, the Arg residue at position 41, and the Tyr residue at position 157 were modified.変した変iso-enzyme においてしい Low activity が cognize められ , catalytic reaction これらの catalytic reaction 応への and が时 instigation された.