分断型アラニンラセマーゼの分子構造形成における細胞内マトリックスの相互作用

丙氨酸消旋酶碎片分子结构形成中的细胞内基质相互作用

基本信息

批准号：
06240231
负责人：
左右田健次
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

タンパク質は本来自発的にフォルディングを行うものと考えられるが、細胞内で新たに生合成されたタンパク質のフォルデイングには、分子シャペロンなどの細胞内マトリックスが関与する。本研究では好熱菌由来のアラニンラセマーゼに高次構造形成における分子シャペロンの関与などについて検討した。ホモダイマー構造をとる同酵素の各サブユニットは2つのドメインよりなる。各ドメインに相当するN‐、C‐両フラグメントの遺伝子を異なるプラスミド上で同一宿主内で共発現させたところ、各々2個のN‐、C‐両フラグメントからなり野性型酵素の50%近い活性を示す断片型酵素が得られた。各フラグメントを別々に発現させた場合は、補酵素結合部位を含む分子量約30,000のN-フラグメントが不溶性の封入対として得られたのに対し、C‐フラグメント(分子量約15,000)の生成は認められなかった。N‐フラグメント遺伝子と共に大腸菌由来の分子シャペロンであるgroESL遺伝子を共発現させたところ、N‐フラグメントの一部は可溶化し、宿主の可溶性画分にアラニンラセマーゼ活性が検出された。また変性剤存在下で断片型アラニンラセマーゼをゲル濾過し変性状態のN‐、C‐両フラグメントを単離し、それらのin vitroにおけるリフォルディングについて検討した。変性した両フラグメントを同時にリフォルディングした場合には、未変性の断片型酵素の約30%の活性が回復した。一方、N‐フラグメントを単独で巻き戻した場合には、ほとんど活性回復は見られなかったが、GroESL共在下でリフォルディングした場合には、活性の回復率は約23%まで上昇した。以上の結果はアラニンラセマーゼではN‐フラグメントが単独で活性を担い、C‐フラグメントはGroESLで代替可能で酵素のフォルディングを補助するものと考えられた。

尽管认为蛋白质自然折叠以自发的方式折叠，但细胞内基质（例如分子伴侣）参与细胞内新生物合成蛋白的折叠。在这项研究中，我们研究了分子伴侣在嗜热细菌中衍生出的分子伴侣参与高阶结构的形成。采用同二聚体结构的酶的每个亚基都由两个结构域组成。当在不同质粒的同一宿主中共表达对应于每个结构域的N-和C构层的基因时，两个N-和C-fragments均产生碎片型酶，表现出近50％的野生型酶活性。当每个片段分别表示时，将其分子量约为30,000的N碎片，含有辅酶结合位点，作为不溶性封装对，而未观察到C碎片（分子量约为15,000）。当共表达GROESL基因时，将源自大肠杆菌的分子伴侣与N-Fragment基因相结合时，溶解了N-碎裂的一部分，并在宿主的可溶性分数中检测到丙氨酸种族酶活性。此外，将碎片的丙氨酸种族酶在具有变性剂的存在下进行凝胶过滤，以分离n-和c片段，并研究了它们的体外重新折叠。当两个变性片段同时重新折叠时，恢复了约30％的天然片段活性。另一方面，当单独恢复N碎片时，几乎没有观察到活动，但是当在Groesl共存下重新折叠时，活动恢复率上升到约23％。以上结果表明，在丙氨酸种族主义酶中，N-Fragment具有独立活性，并且可以用Groesl代替C碎片，并有助于酶的折叠。