制御機能をもつ耐熱性酵素の設計と応用

具有调控功能的耐热酶的设计及应用

• 批准号: 04205071
• 负责人: 左右田 健次
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 1992
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04205071/
• 关键词: NAD結合部位; ロイシンデヒドロゲナーゼ; フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ; ドメイン分断; キメラ酵素; 水素転移立体化学; 耐熱性酵素

耐熱性酵は単に熱安定性に優れているだけではなく、プロテアーゼによる分解などの生物的な作用も受けにくいことから、センサーやバイオリアクターにおける安定な機能素子として利用されている。われわれは、基質特異性は異なるが同種の反応を触媒する、アラニン、ロイシン、フェニルアラニンの各脱水素刻素を種々の好熱菌より単離し、それぞれの一次構造を決定するとともに、これまでに立体構造が決定された各種のNAD(P)依存脱水素酵素との構造比較から、これら3種のアミノ素脱水素酵素には、NAD(P)を結合し、ヒドリドイオンを転移し、酸化還元反応を行う場である触媒性ドメインと、アミノ酸の構造を認識し、これを結合して反応を行う基質結合ドメインの2つの部分から構成されることを示した。このうち後者については、基質認識を行っているいわば調節性のドメインとして機能していることを明らかにした。耐熱性酵素の各ドメインは常温菌由来の酵素のそれに比べて機能的、構造的に強い狭立性を持っていること、さらに、耐熱性酵素においては、各ドメインの独立性が高いため、調節性ドメインに何らかの修飾を加えてもヒドリドイオンの転移という酵素の触媒作用には障害を与えないことを想定し、耐熱性ロイシン脱水素酵素の機能性ドメインにフェニルアラニン脱水素酵の調節性ドメインを結合したキメラタンパク質を作成し、ロイシン脱水素酵素からフェニルアラニン脱水素酵素への変換の有無を検討し、このドメインの構造と機能と関連を検討した。これら一連の研究によって、耐熱声酵素の各ドメインをタンパク質工学の手法を用いて改変し、入れ換えることによって、複合的な機能を持つ素子としての新しい耐熱性酵素を作出できることをはじめて実証した。

Heat resistant yeast は 単 に thermal stability に optimal れ て い る だ け で は な く, プ ロ テ ア ー ゼ に よ る decomposition な ど の biological role in な も by け に く い こ と か ら, セ ン サ ー や バ イ オ リ ア ク タ ー に お け る settle な function element child と し て using さ れ て い る. わ れ わ れ は, substrate specificity は different な る が same の anti 応 を catalyst す る, ア ラ ニ ン, ロ イ シ ン, フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン の has been carved the dehydration, を kinds 々 の hot bacteria よ り 単 し, そ れ ぞ れ の a tectonic を decided す る と と も に, こ れ ま で に three-dimensional structure が decided さ れ た various の NAD (P) dependent dehydrated vegetable enzyme と の than construction Three の is か ら, こ れ ら ア ミ ノ element dehydrated vegetable enzyme に は, NAD (P) を し, ヒ ド リ ド イ オ ン を planning move し, acidification and yuan against 応 を lines う field で あ る catalyst sex ド メ イ ン と, ア ミ ノ acid の tectonic を know し, こ れ を combining し て anti 応 を line う matrix combining ド メ イ ン の 2 つ の part か ら constitute さ れ る こ と を shown し た. こ の う ち latter に つ い て は line, matrix を っ て い る い わ ば regulatory の ド メ イ ン と し て function し て い る こ と を Ming ら か に し た. Heat resistant enzymes の each ド メ イ ン は room temperature bacteria origin の enzyme の そ れ に than べ て function, structure of に strong い narrow vertical を hold っ て い る こ と, さ ら に, heat resistant enzymes に お い て は, various ド メ イ ン の high independence が い た め, regulatory ド メ イ ン に what ら か の modified を plus え て も ヒ ド リ ド イ オ ン の planning move と い の う enzyme catalysis に は Handicap を and え な い こ と を し scenarios, heat-resistant ロ イ シ ン dehydrated vegetable enzyme の functional ド メ イ ン に フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン dewatering element leaven の regulatory ド メ イ ン を combining し た キ メ ラ タ ン パ ク を し, consummate quality ロ イ シ ン dehydrated vegetable enzyme か ら フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン dehydrated vegetable enzyme へ の variations in の whether を beg し 検, こ の ド メ イ ン の と machine construction Be able to と relate を検 to seek た. こ れ ら for の research に よ っ て sound, heat resistant enzymes の each ド メ イ ン を タ ン パ ク の quality engineering technique を with い て change - し, change into れ え る こ と に よ っ て, composite な function を つ element child と し て の new し い heat resistant enzymes を make で き る こ と を は じ め て card be し た.

项目成果

Nobuyoshi Nakajima: "Purification and Characterization of Aldehyde Reductate from Leuconostoc dextranicum" Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry. 57. 160-161 (1993)

Nobuyoshi Nakajima：“右旋明串珠菌醛还原物的纯化和表征”生物科学、生物技术和生物化学。

Takashi Tamura: "Synthesis and Characterization of the Selenium Analog of Glutathione Disulfide" Analytical Biochemistry. 208. 151-154 (1993)

Takashi Tamura：“谷胱甘肽二硫化物的硒类似物的合成和表征”分析生物化学。

Kenji Soda: "Proceeding of the lst International Congress on Vetamins and Biofactotes in Life Science in Kobe,1991" Center for Academic Publications Japan, 606 (1992)

Kenji Soda：“1991 年在神户举行的第一届生命科学中的维生素和生物因子国际会议论文集”日本学术出版中心，606 (1992)

Alvaro Martinez del Pozo: "Inactivation of Dimeric D-Amino Acid Transaminase by A Normal Substrate through Formation of An Unproductive Coenzyme Adduct in One Subunit" Biochemistry. 31. 6018-6023 (1992)

Alvaro Martinez del Pozo：“正常底物通过在一个亚基中形成非生产性辅酶加合物来灭活二聚 D-氨基酸转氨酶”生物化学。

Kumio Yokoigawa: "Theromlabile Alanine Racemase from A Psychrotroph,Pseudomonas fluorescens Purification and Properties" Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry. 57. 93-97 (1993)

Kumio Yokoikawa：“来自耐冷菌、荧光假单胞菌的纯化和特性的不耐热丙氨酸消旋酶”生物科学、生物技术和生物化学。