ハロ酸分解性微生物酵素の遺伝子工学的研究と環境浄化への応用

卤酸降解微生物酶基因工程研究及其在环境净化中的应用

• 批准号: 06271240
• 负责人: 左右田 健次
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06271240/
• 关键词: 加水分解的脱ハロゲン反応; デハロゲナーゼ; L-2-ハロ酸デハロゲナーゼ; DL-2-ハロ酸デハロゲナーゼ; 反応機構; 一時構造

Pseudomonas sp.YLのL-2-ハロ酸デハロゲナーゼは、L-2-ハロ酸の加水分解的脱ハロゲン反応を触媒し、対応するD-2-ヒドロキシ酸を与える。本酵素の触媒反応機構を解析した。1分子の酵素が1回だけ反応を触媒するSingle Turnoverの反応と、1分子の酵素が複数回反応を触媒するMultiple Turnoverの反応をH_2^<18>O中で行い、生成物2-ヒドロキシ酸への^<18>Oの取り込みの有無を調べた。L-2-クロロプロピオン酸を基質としたところ、生成物乳酸への^<18>Oの取り込みはMurltiple Turnoverの反応でのみ認められた。これは、溶媒の水分子の酸素原子が、いったん酵素分子に取り込まれた後、基質に取り込まれたことを示唆している。H_2^<18>O中で反応を行った酵素をプロテアーゼで分解し、得られたペピチド断片をタンデムMS/MS法で分析した結果、Asp10に^<18>Oが取り込まれていることが明らかとなった。以上の結果から、酵素のAsp10の側鎖カルボキシル基が基質のα-炭素を攻撃してハライドイオンが脱離し、生成したエステル中間体が溶媒の水分子によって加水分解されて2-ヒドロキシ酸が遊離するという機構で、反応が進行するものと考えられた。DL-2-ハロ酸デハロゲナーゼは、2-ハロ酸の両異性体に作用し、立体反転で対応する2-ヒドロキシ酸を与える。Pseudomonas sp.113から本酵素の遺伝子を単離し、塩基配列を決定した。ORFは921bpからなり、307アミノ酸をコードしていた。推定分子量は34,242で精製酵素のサブユニット分子量と良い一致を示した。本酵素は、D-体のハロ酸に特異的に作用するD-2-ハロ酸デハロゲナーゼと21.5%の相同性を示した。

Pseudomonas sp. YL の L - 2 - ハ ロ acid デ ハ ロ ゲ ナ ー ゼ は, L - 2 - ハ の ロ acid hydrolysis of ハ ロ ゲ ン anti 応 を catalyst し, 応 seaborne す る D - 2 - ヒ ド ロ キ を シ acid and え る. This enzyme is catalyzed by a 応 mechanism を for analysis of た. 1 molecule of enzyme が1 time だけ reverse 応を catalyst するSingle Turnover 応と reverse 応と, 1 molecule of enzyme が Multiple times reverse 応を catalyst する multiple Turnover の anti 応 を H_2 ^ < > 18 O line で い, products in 2 - ヒ ド ロ キ シ acid へ の ^ < > 18 O の take り 込 み の presence of を adjustable べ た. L - 2 - ク ロ ロ プ ロ ピ オ ン acid を matrix と し た と こ ろ, products へ lactate の ^ < > 18 O の take り 込 み は Murltiple Turnover の anti 応 で の み recognize め ら れ た. こ れ は の acid, solvent の water molecules, atoms が, い っ た ん enzyme molecule に take り 込 ま れ after た, matrix に り 込 ま れ た こ と を in stopping し て い る. H_2 ^ < > 18 O で anti 応 を line っ た enzyme を プ ロ テ ア ー ゼ し で decomposition, and ら れ た ペ ピ チ ド fragment を タ ン デ ム MS/MS analysis method で し た results, Asp10 に ^ < > 18 O が take り 込 ま れ て い る こ と が Ming ら か と な っ た. の above results か ら, enzyme の Asp10 の side chain カ ル ボ キ シ ル base が の alpha carbon matrix を tapping shock し て ハ ラ イ ド イ オ ン が generated from the し し た エ ス テ ル intermediates が solvent の water molecules に よ っ て hydrolytic decomposition さ れ て 2 - ヒ ド ロ キ が シ acid free す る と い う で, anti 応 が for す る も の と exam え ら れ た. DL - 2 - ハ ロ acid デ ハ ロ ゲ ナ ー ゼ は, 2 - ハ ロ acid の struck に role し straight body, three-dimensional inverse planning で 応 seaborne す る 2 - ヒ ド ロ キ を シ acid and え る. Pseudomonas sp.113 伝 ら the 伝 sub-を 単 of this enzyme is separated from 伝, and the base arrangement を determines た た. ORF ア 921bp をコ らな ア, 307ア ア ノ acid をコ ド ド て て た た. The presumed molecular weight is で 34,242で. The refined enzyme is サブユニット. The molecular weight is と and と consistent. Youdaoplaceholder3 shows that it is <s:1> た. This enzyme は, D - の ハ ロ acid に specific に role す る D - 2 - ハ ロ acid デ ハ ロ ゲ ナ ー ゼ と 21.5% の identity を shown し た.

项目成果

V.Nardi-Dei: "Comparative studies of genes encoding thermostable L-2-halo acid dehalogenase from Pseudomonas sp.strain YL,other dehalogenase,and two related hypothetical proteins from Escherichia coli." Appl.Environ.Microbiol.60. 3375-3380 (1994)

V.Nardi-Dei：“来自假单胞菌 YL 菌株的耐热 L-2-卤酸脱卤酶编码基因、其他脱卤酶以及来自大肠杆菌的两种相关假设蛋白的比较研究。”

J.Q.Liu: "Reconsideration of the essential role of a histidine residue of L-2-halo acid dehalogenase" J.Biochem.116. 248-249 (1994)

J.Q.Liu：“重新考虑 L-2-卤酸脱卤酶组氨酸残基的重要作用”J.Biochem.116。