蛋白質とDNAの分子認識における構造的特性と熱力学的特性の相関

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本年度は、以下のDNA結合蛋白質について解析を行った。HU/IHF IHF及びHUのクローンは京都薬科大学の五島氏より提供を受けた。これまでにIHF及びHUの大腸菌による大量発現及び中圧クロマトグラフィーによる精製システムに確立し、カロリメトリー測定に必要な大量の試料を調製することができた。また、filter binding法を用いて結合活性をアッセイした。Reverse Transcriptase HIV-IのReverse Transcriptase(RT)によるDNA結合とストランド合成のメカニズムをさぐるため、filter binding法による熱力学的解析を行った。RTのサンプルは大阪大学の品川氏より譲り受けた。テンプレート/プライマーのモデルとしてG-tractを含む2重鎖DNAとそのmutantに対する結合実験を行ったところ、複合体中におけるG-tractの位置とそのコンフォメーションの重要性が示唆された。また、複合体形成において大きなpH依存性のあることがわかった。Ethylene Responsive Element Binding Protein(EREBP) 植物のエチレンで誘導される遺伝子発現を調節する蛋白質で、生命工学研究所の高木氏からサンプルの提供を受けた。まず、EREBPの配列の解析から、新しいモチーフを持ったDNA結合蛋白質であることが示唆された。EREBPとそのDNA結合サイトとの熱力学解析を行ったところ、小さなドメインにもかかわらず非常に強く結合することがわかった。また、mutantの解析を行い、EREBPが特定の塩基配列を強く認識していることが明らかになった。RecA 理化学研究所の柴田氏との共同研究で、RecAとDNAとの相互作用のモデリングを行い、相同的組換えに影響を与えるmutantをいくつか同定することができた。これらの結果に基づき、RecAとDNAの複合体形成の新しいモデルを提出した。Myb MybR2の構造安定化mutant V103LについてDNA結合の特異性をfilter binding法によりくわしく解析し、wild typeと比較検討した。