無細胞系における収縮環の形勢とその分子機構の解析

本研究の目的は、全真核細胞に共通してM期の全てをcdc2キナーゼが統御していることに着目し、収縮環形成をin vitroでひきおこすことができる無細胞系を開発して、収縮環の形成機構をM期の進行との関連から解明することにある。本年度は、以下の成果を得た。1.無細胞系における収縮環形成の試み:アフリカツメガエル卵抽出物由来の、M期と間期の交互交替を実現できる無細胞系cycling extractsを用いて、収縮環の形成のもととみなされる微小管とアクチンとの相互作用の変動をまず解析した。しかし、cycling extracts中にはアクチンは十分量あり、かつ紡錘体は形成されうるにもかかわらず、細胞周期に応じた微小管とアクチンとの相互作用の変動は検出できなかった。こうした相互作用のためには、細胞表層の存在が必要であると考えられる。そこで、ヒトデ卵から単離した表層をカバーグラスに付着させ、これに単離分裂装置を含むアフリカツメガエル卵cycling extractsを加えることにより、M期終了時に収縮環様のアクチンフイラメント束を無細胞系で形成しうるかを、現在検討中である。2.分裂装置微小管の動態制御:分裂装置微小管の制御には、MAP4のcdc2キナーゼによるリン酸化が関与していることをこれまで明らかにしてきた。そこで、in vivoでMAP4のどの部位がcdc2キナーゼによってリン酸化されるのかを、in vivoでリン酸化されたMAP4とin vitroでcdc2キナーゼによってリン酸化したMAP4とについて、2次元フォスフォペプチド・マッピングを比較することにより検討した。その結果、少なくともMAP4のPro-rich領域中のSer696とSer787がリン酸化部位であることを同定できた。こうしたMAP4のリン酸化部位の同定が星状体微小管の制御と分裂面の決定にいかにかかわるかは、今後の課題である。

本研究の目的は、全真核細胞に共通してM期の全てをcdc2キナーゼが統御していることに着目し、収縮環形成をin vitroでひきおこすことができる無細胞系を開発して、収縮環の形成機構をM期の進行との関連から解明することにある。本年度は、以下の成果を得た。1.無細胞系における収縮環形成の試み:アフリカツメガエル卵抽出物由来の、M期と間期の交互交替を実現できる無細胞系cycling extractsを用いて、収縮環の形成のもととみなされる微小管とアクチンとの相互作用の変動をまず解析した。しかし、cycling extracts中にはアクチンは十分量あり、かつ紡錘体は形成されうるにもかかわらず、細胞周期に応じた微小管とアクチンとの相互作用の変動は検出できなかった。こうした相互作用のためには、細胞表層の存在が必要であると考えられる。そこで、ヒトデ卵から単離した表層をカバーグラスに付着させ、これに単離分裂装置を含むアフリカツメガエル卵cycling extractsを加えることにより、M期終了時に収縮環様のアクチンフイラメント束を無細胞系で形成しうるかを、現在検討中である。2.分裂装置微小管の動態制御:分裂装置微小管の制御には、MAP4のcdc2キナーゼによるリン酸化が関与していることをこれまで明らかにしてきた。そこで、in vivoでMAP4のどの部位がcdc2キナーゼによってリン酸化されるのかを、in vivoでリン酸化されたMAP4とin vitroでcdc2キナーゼによってリン酸化したMAP4とについて、2次元フォスフォペプチド・マッピングを比較することにより検討した。その結果、少なくともMAP4のPro-rich領域中のSer696とSer787がリン酸化部位であることを同定できた。こうしたMAP4のリン酸化部位の同定が星状体微小管の制御と分裂面の決定にいかにかかわるかは、今後の課題である。