分子キメラを用いたグルタミン酸トランスポータの構造機能相関の解析

利用分子嵌合体分析谷氨酸转运蛋白的结构-功能关系

• 批准号: 07276235
• 负责人: 金井 好克
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Kyorin University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07276235/
• 关键词: グルタミン酸; トランスポータ; 構造機能相関; 分子キメラ; アミノ酸; 膜輸送

グルタミン酸トランスポータGLT-1はダルタミン酸取り込み阻害薬ジヒドロカイニン酸(DHK)によってそのグルタミン酸取り込みが抑制されるが、他のアイソフォームEAAC1はDHKによって抑制されない。この薬物感受性の違いを利用して、グルタミン酸トランスポータの基質結合部位同定を目的としたキメラ解析を行った。EAAC1とGLT-1のcDNAをタンデム方向に並ぶように一つのプラスミドに組み込み、recA^+の大腸菌を用いた相同組換によりキメラcDNAを得た。キメラ接合点は、あらかじめEAAC1及びGLT-1cDNAからPCRによって得たDNA断片をプローブとしたドットブロットハイブリダイゼーションによって限定した後、DNAシークエンシングによって決定した。キメラcDNAはXenopus卵母細胞に発現させ、DHKに対する感受性を検討した。膜貫通領域6から7にかけての領域を境にDHK感受性が大きく変化し、この領域内にDHK感受性の決定に与る構造が存在することが示唆された。さらに別の観点から基質結合部位同定の手掛かりを得るために、基質選択性の異なるファミリーの未知のメンバーのクローニングを行い、新しいNa^+依存性中性アミノ酸トランスポータASCT2のcDNAを単離した。ASCT2は、側鎖に高度な分枝や芳香環、複素環を持たない中性アミノ酸を高親和性に輸送した。ASCT2は、低親和性ながらグルタミン酸を基質とすることから、同一のファミリーに属するグルタミン酸トランスポータと似た形の基質結合部位を持つことが示唆された。さらに、ASCT2は、二つのNa^+と共役するグルタミン酸トランスポータと異なり、一つのNa^+と共役していた。キメラ解析から得られたDHK結合領域と、ASCT2とグルタミン酸トランスポータの一次構造と機能的性質の比較から得られた基質結合部位に関する情報をもとに、部位特異的変異導入による解析が進行中である。

グルタミン acid トランスポータGLT-1 はダルタミン acid take り込み疬 ジヒドロカイニン acid (DHK) によっThe てそのグルタミン acid takes the り込みが suppresses the されるが, and his のアイソフォームEAAC1 はDHK によって suppresses the されない.この薬物sensitivity のviolationいをUse して, グルタミン acid トランスポータの matrix binding site with the same purpose としたキメラ analytic を行った. EAAC1とGLT-1のcDNAをタンデムdirectionalに和ぶように一つのプラスミドThe same group of によりキメラcDNA of によりキメラcDNA was obtained by using the same いた group of coliform bacteria.キメjunction point, EAAC1 and GLT-1cDNA PCR and DNA fragmentationとしたドットブロットハイブリダイゼーションによってAfter the restriction, DNA シークエンシングによって is decided.キメラcDNA はThe membrane penetrates the field of 6から7にかけての地を大きく変化し, and the DHK sensitivity in the field is determined and structured.さらに比の観PointからMatrix binding site with the fixed hand hanging かりをget るために、Matrix selection 性のdifferent なるファミリーのUNKNOWN のメンバーのクローニングを行い、新しいNa^+dependent neutral アミノ acid トランスポータASCT2のcDNAを単leaveした. ASCT2 has a side lock, a highly branched aromatic ring, a complex ring, a neutral acid, and a high-affinity transporter. ASCT2は, low affinity ながらグルタミン acid を matrix とすることから, same のファミリーThe に belongs to the するグルタミン acid トランスポータと-like た-shaped の matrix binding site をhold つ こ と が う さ れ た.さらに, ASCT2は, 二つのNa^+と公service するグルタミン acid トランスポータとdifferent なり, 一つのNa^+と公service していた.キメラanalyzes the performance of the DHK combination field and ASCT2 acid トランスポータの primary structure and function The quality comparison and analysis of the matrix binding site and the introduction of site-specific differences are in progress.

项目成果

金井 好克: "Na^+/アミノ酸共輸送蛋白" 日本臨床. 54. 638-645 (1996)

Yoshikatsu Kanai：“Na^+/氨基酸共转运蛋白”日本临床杂志 54. 638-645 (1996)。

金井 好克: "アミノ酸、尿素トランスポータ" 最新医学. 50. 1997-2004 (1995)

Yoshikatsu Kanai：“氨基酸和尿素转运蛋白”现代医学 50。1997-2004（1995）。

Naoko Utsunomiya-Tate: "Cloning and functional characterization of a system ASC-like Na^+-dependent neutral amino acid transporter" The Journal of Biological Chemistry. (印刷中).

Naoko Utsunomiya-Tate：“ASC 类 Na^+ 依赖性中性氨基酸转运蛋白系统的克隆和功能表征”《生物化学杂志》（正在出版）。