ユ-イング肉腫に対する遺伝子治療の基礎的研究-キメラ遺伝子EWS/Fli-1,EWS/ergに対するアンチセンスオリゴDNA,およびリボザイムの抗腫瘍効果の検討-

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ユ-イング肉腫の約90%の症例にキメラ遺伝子EWS-Flilが発現するが、今年度はこのEWS-Flilに対するアンチセンスオリゴDNAとハンマーヘッド型リボザイムを作成し、その抗腫瘍効果を検討した。1 EWS-Flilに対するアンチセンスオリゴDNAのユ-イング肉腫細胞に対する抗腫瘍効果の検討EWS-FlilのmRNAに特異的に結合させるため、アンチセンスオリゴはキメラ遺伝子のfusion pointを含むように設計した。リン酸基の酸素原子の1つをイオウ基に変えたいわゆるフォスフォロチオエ-ト型オリゴヌクレオチド17merを合成し、HPLCにて精製した。(1)FITCでラベルしたオリゴをEWS/Flilを発現するユ-イング肉腫細胞(TC135D)にリポゾームと共に導入し細胞内に移行していることを確認した。(2)オリゴDNAを最終濃度0.1-10μMの範囲で細胞に投与し、MTTアッセイにて細胞増殖抑制能を検討した。細胞増殖速度はアンチセンスオリゴの濃度依存性に減少し、10μMにて3日間培養後実験群の細胞数はコントロール群の約40%にまで減少した。(3)細胞よりRNAを抽出し、RT-PCR法によりキメラ遺伝子の発現変化を調べたところ、アンチセンス群で、有意に減少していた。また、蛋白の発現もFli-l抗体を用いたウエスタン法にて調べ、同様の結果を得た。2 リボザイムのユ-イング肉腫に対する抗腫瘍効果の検討キメラ遺伝子のfusion point近傍を切断するハンマーヘッド型のリボザイムを3種類作成。また、それぞれのリボザイムについてターゲットとなるオリゴヌクレオチドを合成し切断活性を検討した。その結果、2種類のリボザイムに切断活性を認めた。今後in vitroで効果のあったアンチセンスオリゴおよびリボザイムを担癌ヌードマウスに投与し、より臨床応用に即した研究を進めていきたい。