ユ-イング肉腫に対する遺伝子治療の基礎的研究-キメラ遺伝子EWS/Fli-1,EWS/ergに対するアンチセンスオリゴDNA,およびリボザイムの抗腫瘍効果の検討-

尤文氏肉瘤基因治疗的基础研究 - 嵌合基因 EWS/Fli-1、针对 EWS/erg 的反义寡 DNA 和核酶的抗肿瘤作用研究 -

• 批准号: 08266224
• 负责人: 大野 貴敏
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Gifu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08266224/
• 关键词: ユ-イング肉腫; キメラ遺伝子; がん遺伝子; 遺伝子治療; アンチセンスオリゴ; リボザイム; EWS遺伝子; 転写因子

ユ-イング肉腫の約90%の症例にキメラ遺伝子EWS-Flilが発現するが、今年度はこのEWS-Flilに対するアンチセンスオリゴDNAとハンマーヘッド型リボザイムを作成し、その抗腫瘍効果を検討した。1 EWS-Flilに対するアンチセンスオリゴDNAのユ-イング肉腫細胞に対する抗腫瘍効果の検討EWS-FlilのmRNAに特異的に結合させるため、アンチセンスオリゴはキメラ遺伝子のfusion pointを含むように設計した。リン酸基の酸素原子の1つをイオウ基に変えたいわゆるフォスフォロチオエ-ト型オリゴヌクレオチド17merを合成し、HPLCにて精製した。(1)FITCでラベルしたオリゴをEWS/Flilを発現するユ-イング肉腫細胞(TC135D)にリポゾームと共に導入し細胞内に移行していることを確認した。(2)オリゴDNAを最終濃度0.1-10μMの範囲で細胞に投与し、MTTアッセイにて細胞増殖抑制能を検討した。細胞増殖速度はアンチセンスオリゴの濃度依存性に減少し、10μMにて3日間培養後実験群の細胞数はコントロール群の約40%にまで減少した。(3)細胞よりRNAを抽出し、RT-PCR法によりキメラ遺伝子の発現変化を調べたところ、アンチセンス群で、有意に減少していた。また、蛋白の発現もFli-l抗体を用いたウエスタン法にて調べ、同様の結果を得た。2 リボザイムのユ-イング肉腫に対する抗腫瘍効果の検討キメラ遺伝子のfusion point近傍を切断するハンマーヘッド型のリボザイムを3種類作成。また、それぞれのリボザイムについてターゲットとなるオリゴヌクレオチドを合成し切断活性を検討した。その結果、2種類のリボザイムに切断活性を認めた。今後in vitroで効果のあったアンチセンスオリゴおよびリボザイムを担癌ヌードマウスに投与し、より臨床応用に即した研究を進めていきたい。

ユ - イ ン グ meat swollen の about 90% cases の に キ メ ラ posthumous son 伝 EWS - Flil が 発 now す る が, our は "こ の EWS - Flil に す seaborne る ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ DNA と ハ ン マ ー ヘ ッ ド type リ ボ ザ イ ム を し, consummate そ の resistance swollen sores unseen fruit を beg し 検 た. 1 EWS Flil に す seaborne る ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ DNA の ユ - イ ン グ meat swollen cells に す seaborne る resistance swollen sores unseen fruit の 検 for EWS - Flil の mRNA に specific に combining さ せ る た め, ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ は キ メ ラ heritage 伝 son の fusion point を containing む よ う に design し た. リ ン acid base の acid element atoms の 1 つ を イ オ ウ base に - え た い わ ゆ る フ ォ ス フ ォ ロ チ オ エ - ト オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド killing 17 を synthetic し, HPLC に て refined し た. (1) the FITC で ラ ベ ル し た オ リ ゴ を EWS/Flil を 発 now す る ユ - イ ン グ meat swollen cells (TC135D) に リ ポ ゾ ー ム と に total import に し cell migration し て い る こ と を confirm し た. (2) オ リ ゴ DNA を final concentration of 0.1 to 10 microns の van 囲 で cells に cast and し, determined by MTT ア ッ セ イ に て cells raised colonization can inhibit を beg し 検 た. Cells raised colonization rate は ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ の concentration dependence に reduce し, 10 microns に て after 3 day training be 験 group の cell number は コ ン ト ロ ー の ル group about 40% に ま で reduce し た. (3) cell よ を り RNA extraction し, rt-pcr method に よ り キ メ ラ posthumous son 伝 の 発 now - the を adjustable べ た と こ ろ, ア ン チ セ ン ス group で, intentionally に reduce し て い た. Youdaoplaceholder0, the protein is present with <s:1> Fli-l antibody を. The べ is adjusted by the にて たウエスタ たウエスタ <s:1> method にて. The same <s:1> result を is た. 2 リ ボ ザ イ ム の ユ - イ ン グ meat swollen に す seaborne る resistance swollen sores unseen fruit の beg キ 検 メ ラ posthumous son 伝 の fusion point nearly alongside を cut す る ハ ン マ ー ヘ ッ ド type の リ ボ ザ イ ム を 3 kinds. ま た, そ れ ぞ れ の リ ボ ザ イ ム に つ い て タ ー ゲ ッ ト と な る オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を synthetic し cut active を beg し 検 た. Youdaoplaceholder0 そ results, two types of <s:1> リボザ ムに ムに ムに cut off activity を recognize めた. In the future in vitro で unseen fruit の あ っ た ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ お よ び リ ボ ザ イ ム を bear carcinoma ヌ ー ド マ ウ ス に cast and し よ り clinical 応 use に namely し を た research into め て い き た い.