ケキシンファミリー,PACE4アイソフォームの生成機構と細胞機構制御

Kexin家族、PACE4亚型产生机制及细胞机制调控

• 批准号: 08278221
• 负责人: 松田 佳子
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: The University of Tokushima
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08278221/
• 关键词: ケキシンファミリー; アイソフォーム; PACE4; 選択的スプライシング; シスエレメント

(1)PACE4遺伝子構造の解析(辻)PACE5アイソフォームの生成を明らかにするためにはその遺伝子を調べる必要があるが,現在までにヒトゲノムライブラリーをアイソフォーム特異プローブや触媒部位のプローブでスクリーニングした結果,ヒトPACE4遺伝子は約150kbの長さを有し,同一遺伝子上に触媒部位,ホモB領域,各アイソフォーム特異的領域をコードするエクソンが並んでいることが判明しつつある.本年度は,さらに詳細な解析を進め,選択的スプライシングの仕組みを明らかにした.(2)PACE4遺伝子5′-上流域の構造解析(辻)(1)の結果をもとに,PACE4遺伝子の5′-上流域をコードするDNA断片をクローニングし,プライマーエクステンション法を用いて,各種培養細胞及び各種臓器より分離したpoly(A)+RNAを鋳型として転写開始点の決定を行い,各アイソフォームの転写開始点に違いが見られるか明らかにした.(3)PACE4遺伝子5′-上流域の機能解析(松田)5′-上流域DNA断片をレポタ-ジーンであるルシフェラーゼ発現ベクターに組み込み,培養細胞にトランスフェクションを行い,発現したルシフェラーゼ活性を測定することにより,プロモーター領域,発現調節を行うシスエレメントを同定した.(4)PACE4アイソフォームの細胞特異的発現(長浜)各アイソサフォームに対する特異抗体は,合成ペプチドまたはGSTとの融合タンパクを抗原としてウサギ抗体を作製している.また,共通して存在する触媒部位に対する抗体もGST融合タンパクを抗原としてその抗体を作製している.これらの抗体を用いて,ラットの各種臓器内でのPACE4アイソフォームの分布を明らかにした.また,各アイソフォーム共通cRNAプローブ,アイソフォーム特異cRNAプローブによってin situ hybridizationを行い,免疫染色で得られた結果を再度確認し,生理活性ペプチド産生細胞との比較を行った.

(1) Analysis of the structure of PACE4 gene (2)PACE5 gene is about 150kb long, and the catalyst site on the same gene is about B domain. Each of these is unique to its own domain. This year, we have made progress in analyzing the details of the selection process. (2) The structural analysis of the 5′-upstream region of PACE4 gene (1) was carried out. The DNA fragment of the 5′-upstream region of PACE4 gene was isolated from various cultured cells and various instruments by using the method of selection and analysis. The poly(A)+RNA was isolated from the 5′-upstream region of PACE 4 gene and the start point of writing was determined. (3) Functional analysis of PACE4 gene 5′-upstream region (Matsuda)5′-upstream region DNA fragment, including the development of the DNA fragment, culture of cells, detection of the DNA fragment activity, detection of the DNA fragment regulatory activity, and identification of the DNA fragment regulatory activity. (4) The cell-specific expression of PACE4 protein (long) and GST protein (long) in each protein group was studied. The common catalytic site exists in the antibody, GST fusion protein, and antigen. The distribution of these antibodies in various organs of the body is clearly visible. The results of immunostaining were reconfirmed by comparing the physiological activity of the cells produced by the common cRNA and the specific cRNA.

项目成果

Kenji,Mori et al: "A Novel Human PACE4 Isoform,PACE4E si an Active Processing Protease containing a Hydrophobic cluster at the Carboxy Terminus." J.Biochem(Tokyo). 121(5)(in press). (1997)

Kenji, Mori 等人：“一种新型人类 PACE4 同工型，PACE4E 是一种在羧基末端含有疏水簇的活性加工蛋白酶。”

H.Nagamune: "Intermedilsin,a Novel Cytotoxin Specific for Human Cells, Secreted by Streptococcus intermedius UNs46 Isolated from a Human Liver Abscess" Infection and Immunity. 64(8). 3093-3100 (1996)

H.Nagamune：“Intermedilsin，一种针对人类细胞的新型细胞毒素，由从人类肝脓肿中分离出来的中间链球菌 UNs46 分泌”感染和免疫。

A.Tsuji: "Purification and Characterization of a Novel Serine Protease from the Microsomal Fraction of Bovine Pancreas" J.Biochem.119. 100-105 (1996)

A.Tsuji：“来自牛胰腺微粒体部分的新型丝氨酸蛋白酶的纯化和表征”J.Biochem.119。