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脂質性ドメイン解析のための急速凍結・免疫電顕法の開発

脂質性ドメイン解析のための急速凍結・免疫電顕法の開発
用于脂质结构域分析的快速冷冻和免疫电子显微镜的开发
批准号：
13877003
负责人：
藤本 豊士
金额：
$1.02万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
项目状态：
已结题
起止时间：
2001 至 2003
来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13877003/
关键词：
脂質滴急速凍結ADRP凍結割断レプリカNile redSudan III脂肪滴膜ドメイン超微形態免疫電顕極低温電子顕微鏡

项目摘要

项目成果

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脂質滴は内部にコレステロールエステルとトリグリセリドを貯蔵し,外周は燐脂質とフリーコレステロールでできた脂質一重層で覆われている構造である.前年度までの研究により、脂質滴の微細構造は通常の化学固定では保持されないことが確認された.今年度は,従来の急速凍結法を改良し,脂質滴構造を生きた状態のまま高度に保持し,脂質滴構造蛋白質の局在を詳細に明らかにするための方法を確立した.多数の脂質滴を内在性に持つHepG2細胞などの培養細胞を用い,PBSに溶解した10%BSAでリンスしたのち,少量の同液中で機械的に剥離し,短時間の遠心でペレットにした.Leica社製の加圧急速凍結装置EM-PACTの平板凹型の試料台(底部に小孔があり,底部から加圧されるもの)に1-2ulのペレットをいれ,10um厚の銅板を載せて,試料ポッドに規定の圧力で固定し,急速凍結した.ついでBAL-TEC社製の真空凍結割断装置BAF400にて-115℃で割断し,白金・カーボンレプリカを作製した.常温に戻した試料台からレプリカの付着した細胞ペレットを回収し,2.5%SDS in PBS中で60℃,15分処理した.洗浄後,100u/ml DNase Iで37℃,一晩消化し,さらに25%SDS in PBS中で60℃,15分処理してSDS-FRL法による抗体標識に供した.上記の方法により氷晶のない試料のレプリカがコンスタントに得られ,脂質滴は膜内粒子のない平滑な割断面を持つ球として認められた.またADRPは凹面として割れた脂質滴に一面に,また脂質滴を横断するように割れた割断面の円周から一定の距離を持つ標識として観察された.今回の方法は,脂質滴だけでなく,化学固定が困難な他の構造にも応用可能であると考えられる.
期刊论文(10)
专著(0)
科研奖励(0)
会议论文
Aoki, T., Kogure, S., Kogo, H., Hayashi, Y., Ohno-Iwashita, Y., Fujimoto, T.: "Sequestration of cross-linked membrane molecules to caveolae in two different pathways"Acta Histochem.Cytochem.. 36. 165-171 (2003)
Aoki, T.、Kogure, S.、Kogo, H.、Hayashi, Y.、Ohno-Iwashita, Y.、Fujimoto, T.：“交联膜分子以两种不同途径螯合到小窝”《组织化学学报》。
DOI： --
发表时间：
期刊：
影响因子： --
作者： []
通讯作者：
Nakamura, N., Fujimoto, T.: "Adipose-differentiation-related protein has two independent domains for targeting to lipid droplets"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 306. 333-338 (2003)
Nakamura, N., Fujimoto, T.：“脂肪分化相关蛋白有两个独立的结构域用于靶向脂滴”Biochem.Biophys.Res.Commun.. 306. 333-338 (2003)
DOI： --
发表时间：
期刊：
影响因子： --
作者： []
通讯作者：
Tauchi-Sato, K., S.Ozeki, T.Houjou, R.Taguchi, T.Fujimoto: "The surface of lipid droplets is a phospholipid monolayer with a unique fatty acid composition"J.Biol.Chem.. 277. 44507-44512 (2002)
Tauchi-Sato, K., S.Ozeki, T.Houjou, R.Taguchi, T.Fujimoto：“脂滴表面是具有独特脂肪酸组成的磷脂单层”J.Biol.Chem.. 277. 44507
DOI： --
发表时间：
期刊：
影响因子： --
作者： []
通讯作者：
Fukumoto, S., T.Fujimoto: "Deformation of lipid droplets in fixed samples"Histochem.Cell Biol.. 118. 423-428 (2002)
Fukumoto, S., T.Fujimoto：“固定样品中脂滴的变形”Histochem.Cell Biol.. 118. 423-428 (2002)
DOI： --
发表时间：
期刊：
影响因子： --
作者： []
通讯作者：
Elucidation of nuclear lipid droplet functions
  • 批准号：
    22H00446
  • 项目类别：
    Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
  • 资助金额：
    $26.96万
  • 财政年份：
    2022
  • 负责人：
    藤本 豊士
  • 依托单位：
    Juntendo University
がん細胞の増殖,浸潤機構と脂質ドメイン
  • 批准号：
    20013018
  • 项目类别：
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
  • 资助金额：
    $9.41万
  • 财政年份：
    2008
  • 负责人：
    藤本 豊士
  • 依托单位：
    Nagoya University
定量的可視化法による癌細胞でのラフト破綻の解析
  • 批准号：
    18013024
  • 项目类别：
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
  • 资助金额：
    $5.44万
  • 财政年份：
    2006
  • 负责人：
    藤本 豊士
  • 依托单位：
    Nagoya University
イノシトール燐脂質分布の定量的解析
  • 批准号：
    18050012
  • 项目类别：
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
  • 资助金额：
    $3.84万
  • 财政年份：
    2006
  • 负责人：
    藤本 豊士
  • 依托单位：
    Nagoya University
海外基金