Cl^-イメージングで視る局所神経回路機能のダイナミクスとそのシステム的理解

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1.Cl^-と細胞容積の同時モニター法の開発:Cl^-感受性蛍光色素のMEQによるCl^-イメージングでは[Cl^-]_i変化に伴う細胞容積変化による測定誤差の可能性を否定できない。そこで、355nm/490nmの励起光と450nm/520nmの蛍光に対応したdual bandpass filterを作製し、細胞容積変化のみを反映するcalcein(490/520nm)をMEQ(355/450nm)と同時負荷しCl^-と細胞容積の同時モニターによるpseudo-ratiometric Cl^-imaging法を確立した。2.Cl^-イメージングによる新生ラットの細胞タイプ別[Cl^-]_iとGABA作用の差異の解析:神経細胞の静的[Cl^-]_iを生後発達過程の大脳新皮質のCajal-Retzius cell,cortical plate neuronや各層の錐体細胞でCl^-イメージング法で測定した。Cajal-Retzius cellでは[Cl^-]_iは約38mMと高値であった。cortical plate neuronや錐体細胞でも、生直後は約35mMと高値であったが発達とともに低下し、生後3週では7mMに激減した。[Cl^-]_iが高値となる原因はNa^+,K^+-2Cl^-cotransporterによるCl^-取り込みがK^+-Cl^-cotransporterによるCl^-汲み出しに勝るためであると考えられた。また、cortical plateや生後1週の皮質層では、浅層の細胞で深層の細胞より[Cl^-]_iが高い傾向があったが、生後2週でその差は消失した。Cl^-とCa^<2+>のイメージングの結果では、生後10日以前ではGABAによりCl^-流出(=脱分極)がおこりCa^<2+>流入(=興奮)を惹起しているが、それ以降ではCa^<2+>流入は起こらない事が明らかとなった。3.Cl^-ホメオスタシス関連遺伝子群発現状況と[Cl^-]_iの相関の解析:in situ hybridization法で解析した結果、KCC2(K^+-Cl^-cotransporter)mRNAの発現は生後発達とともに増加し、NKCC1の発現は逆に生後発達とともに減少するが、生後2週までは浅層で強く発現し、その後その局所的な差が無くなるとともに発現量も激減した。この結果はCl^-イメージング法の結果を支持していた。