ヒトがん細胞におけるゲノムの異常なメチル化の機構の解明

阐明人类癌细胞中异常基因组甲基化的机制

• 批准号: 16021214
• 负责人: 高井 大哉
• 金额: $ 3.58万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16021214/
• 关键词: がん; ゲノム; DNAメチル化; siRNA

申請者らは以前テトラサイクリン感受性のU6プロモータを用いて,テトラサイクリン誘導性ヘアピンsiRNAの発現システムを構築し,DNA methyltransferase 1(DNMT1)を標的として,ウェスタンブロットで検出不能となる程度まで発現が抑制される事を示した.本課題では,ほ乳類で活性が確認されているこのほかのDNMTである,DNMT3A, DNMT3Bをテトラサイクリン誘導性ヘアピンsiRNAを用いてノックダウンし,その機能の解析を行うことを目指している.本年度はベクターの改良ならびにヘアピンのループの及ぼす転写抑制に対する影響を検討しつつ,DNMT3A, DNMT3Bに対するヘアピンsiRNAベクターの構築を行った.まず,ヘアピンsiRNAベクターの構築については,最近報告された,いくつかの点を参考に改良を行った.まず,以前我々が構築したU6プロモーターのベクターは,Promega社pGEM-TEasyを骨格としているため,ヘアピンをコードするオリゴDNAの挿入について用いることのできる制限酵素認識配列が,AatIIおよびApaIしかなく,また,AatIIがスター活性を有するため,ヘアピンsiRNAベクター構築時のオリゴDNAの挿入にはしばしば難渋した.このため,プロモーターの下流に50塩基のオリゴDNAを挿入,新たに9つの制限酵素認識配列(XmaI,NarI,XhoI,BglII,XbaI,HindII,AflII,BamHI,MfeI)を構築した.DNMT3Aについては5つの異なる部位を標的とするベクターを構築し,ウェスタンブロットを用いて,その効果を検討したところ,2つのヘアピンsiRNAで,発現量が50%まで抑制されるベクターが得られた.ヘアピンのループについてはBrummelkampらの報告[Brummelkamp et al.,science 296(5567):550-3(2002)]に則りTTCAAGAGAの9塩基を用いた.また,最近のMiyagishiらのGTGTGCTGTCC[Miyagishi et al.,J Gene Med.;6(7):715-23(2004)],以前申請者らが報告したAatII配列GACGTCについても,同じ標的配列を用いて比較をしたところ,予想に反して,AatII配列が最も,発現抑制効果が強く,siRNAの転写量等について,現在検討の準備を行っている.一方DNMT3Bについては,ウェスタンブロットで,これまでのところ構築したヘアピンsiRNAベクターでは発現量が70%程度にまで抑制されるベクターを得ている.

Applicants have demonstrated the extent to which the detection of U6 receptor receptors is inhibited by the use of DNA methyltransferase 1(DNMT1) as a target for the construction of a receptor inducible siRNA development system. This project aims to confirm the activity of DNMT, DNMT3A and DNMT3B, and analyze their functions. This year, we will review the impact of the improvement of the target site and its inhibition on DNMT3A and DNMT3B, and conduct the construction of target site siRNA. In addition, we have recently reported on the improvement of siRNA construction. In the past, we have constructed U6 siRNA, but Promega pGEM-TEasy has not been able to control the enzyme recognition sequence. AatII siRNA has not been constructed. AatII siRNA has been constructed. 50-base DNA insertion, 9-base restriction enzyme recognition and alignment (XmaI,NarI,XhoI,BglII,XbaI,HindII,AflII,BamHI,MfeI) was constructed. DNMT3A was constructed with 5 different sites marked with 5 different sites. 50% reduction in emission. Report of Brummelkamp [Brummelkamp et al., science 296(5567):550-3(2002)]また,最近のMiyagishiらのGTGTGCTGTCC[Miyagishi et al., J Gene Med.; 6(7):715-23(2004)], AatII was previously reported to be the most effective candidate for GACGTC, compared with the same candidate for siRNA, and now we are preparing for the review. A DNMT3B vector was constructed to suppress the expression of siRNA by 70%.

项目成果

New therapeutic key for cystic fibrosis: a role for lipoxins

• DOI: 10.1038/ni0404-357
• 发表时间: 2004-04
• 期刊: Nature Immunology
• 影响因子: 30.5
• 作者: D. Takai;T. Nagase;Takao Shimizu

Origins of bidirectional promoters: Computational analyses of intergenic distance in the human genome

• DOI: 10.1093/molbev/msh040
• 发表时间: 2004-03-01
• 期刊: MOLECULAR BIOLOGY AND EVOLUTION
• 影响因子: 10.7
• 作者: Takai, D;Jones, PA
• 通讯作者: Jones, PA

統計物理化学から学ぶバイオインフォマティクス

从统计物理化学中学到的生物信息学

• 发表时间: 2004
• 作者: Peter Clote;(高木利久 監訳)
• 通讯作者: (高木利久 監訳)

Distinct localization of histone H3 acetylation and H3-K4 methylation to the transcription start sites in the human genome

• DOI: 10.1073/pnas.0401866101
• 发表时间: 2004-05-11
• 期刊: PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA
• 影响因子: 11.1
• 作者: Liang, GN;Lin, JCY;Jones, PA
• 通讯作者: Jones, PA