ヒト遺伝子ノックアウトシステムの効率化と疾患遺伝子機能解析への応用

提高人类基因敲除系统效率及其在疾病基因功能分析中的应用

基本信息

批准号：
20018022
负责人：
足立典隆
金额：
$ 4.67万
依托单位：
Yokohama City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

DNA鎖切断修復経路の異常や欠損はさまざまな遺伝病やがんと密接に関連している.我々は最近,ヒトpre-B由来リンパ球細胞株Nalm-6を用いて,遺伝子ノックアウト細胞を効率良く取得できるシステムの開発に成功した.そこで本研究では,DNA鎖切断修復に関わるヒト遺伝子について系統的に遺伝子ノックアウトを行い,得られた変異細胞株の表現型解析を行った.特に本研究では,遺伝子間あるいは経路間の相互作用の解析を目的として,二重変異株の作製と解析を進め,主に以下の成果を得た.・NHEJ欠損細胞は,エトポシドなどのトポイソメラーゼII阻害剤に高感受性を示す一方,カンプトテシン(トポイソメラーゼI阻害剤)やParp阻害剤に対しては耐性を示す.・ヒト細胞でNHEJを欠損させるとジーンターゲティング効率の上昇がみられる.・TDP1やAPTX(ともに脊髄小脳失調症の原因遺伝子)を欠損した細胞は,ブレオマイシンに対して高感受性を示す.・DNA ligaseIVとDNAポリメラーゼβは,DNA修復において部分的にオーバーラップした機能をもつ.一方,ヒト細胞には複数のランダムインテグレーション機構が存在しており,ターゲティングベクターと非ターゲティングベクターとでインテグレーションの機構が異なっている可能性が高いことがわかったため,ベクターの構造,特に相同領域中の反復配列がインテグレーション反応に及ぼす影響を詳細に解析した.この成果は,今後の遺伝子ノックアウト研究に重要な示唆を与えると期待される.

DNA链破裂修复途径中的异常和缺陷与各种遗传疾病和癌症密切相关。我们最近成功地开发了一个可以使用人类前B衍生的淋巴细胞细胞系NALM-6有效地获得基因基因敲除细胞的系统。因此，在这项研究中，我们系统地淘汰了参与DNA链断裂修复的人类基因和所获得的突变细胞系的表型分析。特别是，这项研究旨在分析基因间或途径相互作用。进行了双重突变菌株的生产和分析，并主要获得结果。 -NHEJ缺陷型细胞对拓扑异构酶II抑制剂（如依托泊苷）高度敏感，但对camptothecin（拓扑异构酶I抑制剂）和PARP抑制剂具有抗性。 - 人类细胞中NHEJ缺乏会提高基因靶向效率。 - 缺乏TDP1和APTX的细胞（两个负责脊髓性共济失调的基因）对博来霉素高度敏感。 - DNA链氨维和DNA聚合酶β在DNA修复中具有部分重叠的功能。但是，人类细胞具有多种随机整合机制，并且靶向矢量和非目标向量之间的整合机制可能有所不同，我们已经详细分析了向量结构的影响，尤其是同源区域中的重复序列，对整合反应。这一发现有望为未来的基因敲除研究提供重要建议。