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無細胞転写系によるチトクロームP-450C遺伝子発現調節の分子機構の解析

利用无细胞转录系统分析细胞色素P-450C基因表达调控的分子机制

基本信息

批准号：
63635501
负责人：
半田宏
金额：
$ 0.96万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至 1989
项目状态：
已结题

项目摘要

チトクロームP-450Cはメチルコラントレンで誘導発現され、その誘導発現はアデノウイルスE1A蛋白質で抑制される。本研究の目的はそれら発現制御機構を無細胞転写系を用いて分子レベルで解明することである。メチルコラントレン処理および未処理HeLa細胞から核抽出液を作製し、この核抽出液とチトクロームP-450C遺伝子野生株および欠損変異株のプロモーター領域を含むプラスミドDNAと基質(NTP'S)からなる反応液で試験管内でRNAを合成する。RNA量はプロモーター活性に応じて合成されるので、転写活性に必要なDNA上の部位(塩基配列)を固定することで出来る。この系を用いて得られた結果は(1)チトクロームP-450C遺伝子の転写開始部位より上流6300塩基対を含んだプロモーターでは、メチルコラントレン処理したHeLa細胞核抽出液の方が未処理のものと比べて数倍高い活性が得られた。このことは試験管内で行う無細胞転写系でもメチルコラントレン処理によるチトクロームP-450C遺伝子の細胞内誘導発現が完全ではないにしろ部分的に見られることを示唆する。(2)5^´上流域における一連の欠損変異株の転写活性を検討すると、-44塩基対まで欠損すると転写活性は極端に下がるが、-55塩基対までのものでは転写活性は野生株と同程度にまで保存されており、更にメチルコラントレンによる転写促進も起こる。これらのことから無細胞転写系で制御機構が解析出来るのは-55塩基対までに存在する塩基配列が関与する誘導発現で、それら以外のエンハンサー等の関与は現時点では解析出来ないことがわかった。今後、この系を改良し、エンハンサー効果も見られる無細胞転写系を確立するとともに、アデノウイルスEIAによる転写抑制機構を明らかにするつもりでいる。

P-450C is a protein inhibitor that can induce and inhibit E1A protein expression. The aim of this study is to develop a new molecular mechanism for the development of cell-free DNA. HeLa cells were treated and untreated for DNA synthesis in nuclear extracts, nuclear extracts, P-450C gene fragments, wild strains, deficient mutants, and RNA synthesis in test tubes containing DNA and substrate (NTP'S). The RNA quantity is determined by the fixation of sites on DNA necessary for the synthesis of RNA activity and for the alignment of RNA bases. The results showed that: (1) the activity of the P-450C gene was several times higher than that of the untreated HeLa cell nuclear extract, and the activity was higher than that of the untreated HeLa cell nuclear extract. The intracellular induction of P-450C gene in the cell-free culture system was completely completed in vitro. (2)5 In the upper watershed, the activity of a series of under-damaged mutants was investigated, and the activity of the under-damaged mutants was extremely low, and the activity of the under-damaged mutants was extremely low, and the activity of the under-damaged mutants was low, and the activity of the wild mutants was high, and the activity of the under-damaged mutants was high. The control mechanism of cell-free writing system is analyzed, and the relationship between the basic arrangement and the current point is analyzed. In the future, this system will be improved, and the results will be seen. Cell-free writing system will be established.